|
Construction de banques d'ADNc de semences de Pisum sativum et de Medicago truncatula Purification des ARN messagers |
|
Le principe du système utilisé pour la purification des ARNm repose sur l'affinité entre la biotine et la streptavidine : voir un shéma du protocole. Le tableau suivant résume les quantités d'ARN totaux traitées pour chaque échantillon. |
| Matériel biologique | Pisum sativum | Medicago truncatula | ||
| Temps d'imbibition | 12 h | 22 h | 10 h | 30 h |
| ARN totaux (µL) | 2 x 500 | 2 x 500 | 30 | 30 |
| ARN totaux (µg) | 2 x 488 | 2 x 264 | 135 | 278 |
| Eau - DEPC (µL) | 0 | 0 | 470 | 470 |
Les ARN totaux sont d'abord incubés à 65°C pendant 10 min afin de rompre les liaisons hydrogène responsables de structures secondaires. Les acides nucléiques sont ainsi linéarisés. Après addition de 3 µl d'oligo(dT) biotinylé et de 13 µl de SSC (NaCl 3 M, citrate de sodium 0,3 M, pH 7,2 ; concentration finale 0,5X), le mélange est incubé à température ambiante pendant 10 min pour permettre l'hybridation des oligo(dT) biotinylés à la queue poly-A+ des ARN messagers. Les hybrides sont mis au contact de billes magnétiques sur lesquelles sont greffées des molécules de streptavidine, pendant 10 min avec agitation régulière. Les billes ont été préalablement équilibrées en SSC 0,5X. Les hybrides ARNm - oligo(dT) biotinylés se lient à la streptavidine et l'ensemble est isolé par aimantation. Les billes ont été ensuite lavées 4 fois avec du SSC 0,1X. Les ARN messagers sont élués par 2 lavages à l'eau - DEPC (diéthyl pyrocarbonate, inhibiteur des RNases). En effet, l'élimination de sel rompt les liaisons hydrogène entre la queue poly-A+ des ARNm et l'oligo(dT). Les ARNm ont été précipités à l'acétate de sodium 0,3 M et l'isopropanol puis centrifugés (12000 g, 10 min). Ils ont ensuite été lavés à l'éthanol 70 % puis suspendus dans l'eau - DEPC. La concentration et l'intégrité des ARNm ont été déterminées respectivement par la mesure d'absorbance à trois longueurs d'onde et par un gel d'électrophorèse (agarose 1%) en conditions dénaturantes (conditions décrites dans la partie "Extraction des ARN totaux"). Remarque : ces deux méthodes d'analyse ne donnent pas toujours des résultats probants en ce qui concerne les ARN messagers (ARNm). En effet, ceux-ci ne représentant qu'environ 1 % à 5 % des ARN totaux (selon les organismes et les tissus), les quantités d'ARNm purifiés sont souvent très faibles et, de ce fait, la valeur déterminée par la mesure de fluorescence souffre d'incertitude. Par voie de conséquence, on ne dispose pas toujours de la quantité minimale à déposer sur gel pour visualiser les ARNm (environ 1 à 2 µg). Enfin, il faut faire un compromis :
|