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a. Extrait brut et précipitation au sulfate d’ammonium

b. Chromatographie échangeuse d’anions DEAE-cellulose

c. Chromatographie d’affinité pigments

d. Chromatographie d’affinité NAD/ATP

e. Chromatographie d’exclusion stérique Superdex G200

f. Electrophorèse SDS-PAGE

g. Tableau de purification

 

a. Extrait brut et précipitation au sulfate d’ammonium

L’activité totale aminante de la NADPH-GDH est de 14456 nmol.min-1 et la quantité de protéines totales est de 3838 mg. L’activité spécifique est alors de 3.8 nmol.min-1.mg-1.

Après la précipitation au sulfate d’ammonium, l’activité totale aminante de la NADPH-GDH est de 8565 nmol.min-1 et la quantité de protéines totales est de 2469 mg. L’activité spécifique est alors de 3.5 nmol.min-1.mg-1. Cette étape permet de récupérer 59% de l’activité enzymatique, et le facteur de purification est de 0.92.

b. Chromatographie échangeuse d’anions DEAE-cellulose

Le dialysat récupéré après précipitation au sulfate d’ammonium est chargé sur un gel DEAE-cellulose. 80 fractions de 1 mL sont collectées par élution au NaCl (0 à 0.5 M). L’absorbance à 280 nm permettant d’avoir une estimation de la quantité de protéines, et l’activité aminante de la NADPH-GDH, sont mesurées sur une fraction sur deux.

Le profil d’élution obtenu (figure 8) met en évidence 2 pics d’activité totale maximale entre 25 et 43 mL, et entre 49 et 62 mL. Ces deux pics d’activité totale correspondent quasiment aux deux pics majoritaires de protéines mesurées à 280 nm. Les fractions de 25 à 43 mL sont réunies (POOL 1), ainsi que les fractions de 49 à 62 mL (POOL 2).

Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous :

POOL 1

POOL 2

Activité totale = 3777 nmol.min-1

Activité totale = 3364 nmol.min-1

Protéines = 595 mg

Protéines = 473 mg

Activité spécifique = 6.35 nmol.min-1.mg-1

Activité spécifique = 7.11 nmol.min-1.mg-1

Facteur purification = 1.67

Facteur purification = 1.87

Rendement = 26%

Rendement = 23%

c. Chromatographie d’affinité pigments

Chaque pool est chargé sur le gel Pigments. 80 fractions de 1 mL sont collectées par élution de NaCl (0 à 1 M). De même que la chromatographie précédente, l’absorbance à 280 nm permettant d’avoir une estimation de la quantité de protéines, et l’activité aminante de la NADPH-GDH, sont mesurées sur une fraction sur deux.

A nouveau, 2 pics d’activité totale sont mis en évidence sur le profil d’élution de chaque pool (figures 9 et 10). En ce qui concerne les pics de protéines totales sur les profils d’élution, ils ne correspondent pas aux pics d’activité totale GDH.

Ces nouveaux pools seront nommés POOL A, POOL B, POOL C, POOL D.

Les résultats sont résumés dans le tableau suivant :

POOL 1

POOL 2

POOL A

POOL B

POOL C

POOL D

Activité totale = 84 nmol.min-1

Activité totale = 1841 nmol.min-1

 

Activité totale = 441 nmol.min-1

Protéines = 4.83 mg

Protéines = 13.28 mg

Protéines = 7.94 mg

Activité spécifique = 17.4 nmol.min-1.mg-1

Activité spécifique = 138.6 nmol.min-1.mg-1

Activité spécifique = 55.5 nmol.min-1.mg-1

Facteur purification = 4.7

Facteur purification = 36.5

Facteur purification = 14.6

Rendement = 0.6%

Rendement = 13%

Rendement = 3%

Le pool C a été perdu durant les manipulations.

Les POOLS B et D seront chargés sur un gel de chromatographie d’affinité ATP/NAD car ce sont les pools où il y a l’activité totale est la plus importante.

d. Chromatographie d’affinité NAD/ATP

Les POOLS B et D sont chargés chacun leur tour sur un gel d’affinité NAD/ATP. La NADPH-GDH est spécifique du NADP(H), elle ne se fixera donc pas sur le gel. Pour chaque pool, l’activité sera récupérée dans la charge et dans le rinçage.

Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous :

POOL B

POOL D

Activité totale = 1733 nmol.min-1

Activité totale = 130 nmol.min-1

Protéines = 14.83 mg

Protéines = 1.7 mg

Activité spécifique = 116.86 nmol.min-1.mg-1

Activité spécifique = 76.47 nmol.min-1.mg-1

Facteur purification = 30.75

Facteur purification = 20.12

Rendement = 12%

Rendement = 1%

On remarque que les résultats sont relativement semblables pour le POOL B entre cette chromatographie et la chromatographie précédente. Il n’y pas eu purification.

En revanche, en ce qui concerne le POOL D, il y a eu une légère purification.

e. Chromatographie d’exclusion stérique Superdex G200

Les POOLS B et D sont chargés sur le gel de chromatographie d’exclusion stérique Superdex G200, après calibration de ce dernier.

Les profils d’élution de chacun des deux pools sont représentés sur les figures respectives 11 et 12.

D’après l’équation de droite de calibration (figure 7), sont éluées des protéines de 360 120 Da (pic 1), 75 325 Da (pic 2), 54 455 Da (pic 3) pour le POOL B.

Sont éluées des protéines de 157 749 Da (pic 4), 114 513 Da (pic 5) et 89 137 Da (pic 6) pour le POOL D.

f. Electrophorèse SDS-PAGE

L’électrophorèse SDS-PAGE permet non seulement de déterminer le PM des sous-unités mais également de se rendre compte du degré de purification au fil des étapes de purification (figure 13).

En ce qui concerne l’extrait brut et le dialysat obtenu après précipitation au sulfate d’ammonium, ces échantillons sont très riches en protéines et peu de bandes se distinguent les unes des autres.

On remarque également que les contenus protéiques révélés dans le POOL 1 et le POOL 2, issus de la DEAE-cellulose ne sont pas les mêmes.

Dans le POOL 1, des protéines dont les sous-unités ont un PM de 27 et 35 kDa sont davantage  présentes alors que dans le POOL 2, des protéines dont les sous-unités ont un PM de 40 et 48 kDa sont majoritaires. Il a donc été judicieux de séparer ces pools.

Puis, il faut noter que l’on retrouve ces sous-unités de 35 kDa dans le POOL B issu du POOL 1 et les sous-unités de 48 kDa dans le POOL D issu du POOL 2. Ces résultats sont donc cohérents.

On observe également qu’une autre bande se distingue légèrement dans le POOL B, il s’agit de sous-unités de 45 kDa.

g. Tableau de purification

En ce qui concerne le tableau de purification, on ne tient pas compte des différents pools obtenus.

On répertorie la globalité des protéines totales, de l’activité totale GDH aminante, l’activité spécifique GDH aminante, et ceci pour chaque étape de purification.

La troisième chromatographie (NAD/ATP) donne un rendement de 13%, un facteur de purification proche de 30, une activité totale de 1863 nmol.min-1 et une activité spécifique de 112.7 nmol.min-1.mg-1.

L’activité totale et spécifique de la GDH sont sous-estimées car il y a encore beaucoup de protéines (16.53 mg). En effet, il y a une inactivation de la GDH au cours du temps.

Il s’est passé deux mois entre l’extraction de l’enzyme et cette chromatographie.

L’inactivation de l’enzyme est plus rapide que le temps nécessaire pour la mise au point du protocole de purification.

Ainsi, l’enzyme est présente mais inactive. Ce qui fausse les résultats.