Méthodes

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1. Mesure de l’activité aminante et désaminante de la GDHet dosage des protéines totales

2. Purification de la GDH EC 1.4.1.4

a. Matériel biologique - Extrait brut

b. Précipitation au sulfate d’ammonium

c. Chromatographie échangeuse d’anions DEAE-cellulose

d. Chromatographie d’affinité pigments

e. Chromatographie d’affinité NAD/ATP

f. Chromatographie d’exclusion stérique Superdex G200

g. Electrophorèse SDS-PAGE

 

1. Mesure de l’activité aminante et désaminante de la GDH et dosage des protéines totales

  • L’activité aminante de la GDH dépendante du NADPH est mesurée en suivant la consommation du NADPH par spectrophotométrie à 340 nm, à 30°C.
  • Le mélange réactionnel contient :

HEPES

50 mM, pH6.8

a-cétoglutarate

20 mM

NH4Cl

50 mM

NADPH

0.2 mM

Mélange enzymatique

X mL

Eau distillée

Qsp 1mL

  • Mesure de l’activité désaminante :Pour savoir si l’activité aminante mesurée n’est pas celle de l’isoforme [EC 1.4.1.2] qu’elle peut catalyser de façon non préférentielle, l’activité désaminante est également mesurée sur chaque échantillon. C’est la formation du NADH qui est alors suivie à 340 nm et à 30°C.
  • Pour cette réaction, le substrat est le glutamate 1 M , le coenzyme est le NAD 50 mM, et du tampon Hepes 50 mM pH 6.8 est ajouté.

 La concentration en protéines totales est déterminée avec le réactif Bio-Rad selon la technique de Bradford (1976) en utilisant l'albumine de sérum bovin comme standard.

 

2. Purification de la GDH EC 1.4.1.4

a. Matériel biologique - Extrait brut

  • Le matériel biologique utilisé est des semences de pois (Pisum sativum) imbibées pendant 12 et 22 heures.
  • L’extrait brut est obtenu en broyant des semences de pois selon un rapport 1g de semences dans 4 mL de tampon d’extraction.
  • Le tampon d’extraction contenant 50 mM Hepes pH7.5, 2 mM EDTA, 1 mM ßmercaptoéthanol, 1 mM PMSF.
  • L’extrait brut est clarifié par centrifugation (30 min, 27 000g, 4°C). On récupère le surnageant.

b. Précipitation au sulfate d’ammonium

  • Le surnageant est précipité par du sulfate d’ammonium (70% saturation), puis centrifugé (30 min, 27000g, 4°C).
  • Le culot récupéré est repris dans un volume minimal de tampon d’extraction avec 20% de saturation de sulfate d’ammonium et dialysé contre 5L de tampon d’extraction, toute une nuit à 4°C.

c. Chromatographie échangeuse d’anions DEAE-cellulose

  • Le dialysat est alors chargé sur un gel de chromatographie échangeuse d’anions DEAE-cellulose, équilibré avec du tampon d’extraction et élué par un gradient de NaCl (0 à 0.5 M) dans du tampon d’extraction. Des fractions de 1 mL sont collectées avec un débit de 0.3 mL/min.
  • Les fractions actives sont ensuite réunies.

d. Chromatographie d’affinité pigments

  • L’éluat actif est chargé sur un gel de chromatographie d’affinité pigments, équilibré avec du tampon d’extraction et élué par un gradient de NaCl (0 à 1 M) dans du tampon d’extraction.
  • Des fractions de 1 mL sont collectées avec un débit de 0.24mL/min.
  • Les fractions actives sont réunies.

e. Chromatographie d’affinité NAD/ATP

  • L’éluat actif est chargé sur un gel de chromatographie d’affinité NAD/ATP équilibré avec du tampon d’extraction (débit = 0.18 mL/min). L’activité est récupérée dans la charge et le rinçage.
  • La charge et le rinçage sont réunis et concentrés contre 2L de PEG (polyéthylène glycol).
  • Ceci permet de récupérer l’activité dans un petit volume.

f. Chromatographie d’exclusion stérique Superdex G200

  • Ce type de chromatographie permet non seulement de séparer les protéines mais également de déterminer le poids moléculaire des protéines.
  • Afin de déterminer le poids moléculaire (PM) des protéines éluées, des protéines de référence encore appelées marqueurs de PM connus sont déposées sur le gel. Il s’agit de la thyroglobuline (669 kDa), la ferritine (440 kDa), la catalase (232 kDa), la lactate déshydrogénase (140 kDa) et l’albumine (66 kDa).
  • Le domaine de fractionnement du gel Superdex G200 est compris entre 104 et 6.105 Da. Ainsi, en utilisant le Bleu Dextran, de très haut poids moléculaire, 2.106 Da, le volume mort Vo peut être déterminé. Ici, Vo=15 mL. La thyroglobuline est éluée avec le Bleu Dextran car son PM est supérieur au domaine de fractionnement.
  • Le profil d’élution (figure 6) est tracé après la mesure d’absorbance à 280 nm de chaque fraction éluée (fraction de 1 mL).
  • Le volume d’élution Ve de chaque protéine de référence est déterminé. La droite de calibration Ve/Vo = f (log PM) peut être tracée (figure 7).
  • L’échantillon concentré au PEG est alors chargé sur le gel. L’élution se fait par passage du tampon d’extraction avec un débit de 0.14 mL/min. Puis le poids moléculaire des protéines éluées peut être déduit.

g. Electrophorèse SDS-PAGE

  • Le principe de la SDS-PAGE est de traiter l’échantillon protéique avec un agent réducteur (b mercaptoéthanol) pour rompre les ponts disulfures et un détergent anionique (SDS) qui dénature les protéines et leur confère une enveloppe de charge négative (Hames B.D. et al., 2000).
  • L’échantillon est fractionné par une électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10%.
  • Tous les fragments protéiques sont séparés selon leur poids moléculaire qui est déterminé grâce à des marqueurs. Les protéines standards utilisées sont  des marqueurs de bas poids moléculaires contenant la phosphorylase b (97 kDa), l’albumine (66 kDa), l’ovalbumine (45 kDa), l’anhydrase carbonique (30 kDa), l’inhibiteur de trypsine (20,1 kDa), et l’a lactalbumine (14,4 kDa).
  • Cette technique permet de déterminer le poids moléculaire des sous-unités formant une protéine, et de se rendre compte du degré de purification atteint à chaque étape.