Étude d'un hexapeptide |
Tweet |
![]() |
Déterminez la séquence d'une hormone hexapeptidique d'après les résultats suivants en expliquant le raisonnement. 1. L'incubation du peptide avec le phénylisothiocyanate, réactif de la méthode de dégradation d'Edman, ne donne aucune réaction. 2. L'action de la trypsine donne 2 fragments I et II. I est Arg. Après hydrolyse par HCl, II est composé de : 2 Asp / 1 Met / 1 Leu / 1 Lys et 1 NH3. Après un cycle de dégradation d'Edman, un tétrapeptide et la PTH-Met sont libérés à partir de II. 3. La titration de l'hexapeptide de pH 1 à pH 13 nécessite 3 équivalents OH par mole de peptide et les pKa des groupes ionisables sont : 3,9 - 10,5 - 12,5. 4. Le traitement de l'hexapeptide par le bromure de cyanogène (BrCN) donne un seul peptide qui, après un cycle de dégradation d'Edman, libère le PTH-Asp. 5. Le traitement de l'hexapeptide par la protéase de staphylocoque (qui hydrolyse les peptides du côté C-terminal des résidus glutamyle et aspartyle) donne un peptide qui, après un cycle de dégradation d'Edman, libère la PTH-Asn. |
1. Le phénylisothiocyanate (PITC) n'agit que sur une fonction aminée libre (primaire ou secondaire comme la proline). Le PITC est utilisé pour la quantification des acides aminés par HPLC lors de la dégradation d'Edman pour le séquençage des protéines. S'il n'y a pas de réaction avec le PITC, c'est que l'acide aminé N-terminal est bloqué. Beaucoup de séquences de protéines d'Eucaryotes sont protégées des aminopeptidases par un acide aminé en position N-terminale qui est bloqué. |
Exemple de protection : acétylation et cyclisation de la glutamine N-terminale des immunoglobulines qui forme le pyroglutamate.
La pyroglutamate aminopeptidase (EC 3.4.19.3) décyclise le pyroglutamate et libère la fonction aminée N-terminale. Autres exemples : l'acétylserine et la N-acétylthreonine sont 2 autres acides aminés bloqués. |
|
Dans cet exercice, une autre possibilité est que le peptide soit circulaire : il n'y a alors ni acide aminé N-terminal, ni acide aminé C-terminal. |
2. La trypsine (EC 3.4.21.4) hydrolyse la liaison peptidique après Arg et Lys sauf si ces acides aminés sont suivis par une proline. Cependant elle peut avoir une spécificité plus complexe. On n'obtient que 2 fragments bien que l'hexapeptide contienne 1 Arg et 1 Lys et qu'il n'y ait pas de Pro. Si l'hexapeptide
est linéaire,
l'un des deux acides aminés (Arg ou Lys) doit se trouver en position
C-terminale : |
Cependant, puisque l'acide aminé N-terminal est bloqué (question N°1), celà confirme que l'hexapeptide est circulaire. |
|
3. Titration de l'hexapeptide Hydrolyse totale acide
Hydrolyse totale alcaline
|
La titration de l'hexapeptide donne : |
1 équivalent OH ---> pKa = 3,9 | 1 équivalent OH ---> pKa = 10,5 | 1 équivalent OH ---> pKa = 12,5 |
===> 1 Asp Or la composition en acides aminés indique qu'il y a 2 Asp et 1 NH3. Donc, l'un des 2 Asp provient de la transformation d'une Asn en [Asp + NH3] lors de l'hydrolyse acide pour la détermination de la composition en acides aminés. |
===> 1 Lys | ===> 1 Arg |
4. Le bromure de cyanogène ("cyanogen bromide" - BrCN) réagit spécifiquement avec la méthionine et produit des peptides portant un résidu homosérine lactone à l'extrémité C-terminale. On n'obtient qu'un peptide, ce qui confirme que l'hexapeptide est circulaire. La libération du PTH-Asp (nouveau résidu en position N-terminale après action de BrCN) indique que X = Asp. Soit la séquence : [Arg - Met - Asp - Y - Z - Lys]. |
5. Action de la protéase de staphylocoque D'après la composition en acides aminés, il y a 1 Asp et pas de Glu. L'hexapeptidique étant circulaire, on obtient donc qu'un fragment. La libération du PTH-Asn (nouveau N-terminal après action de la protéase), indique que Y = Asn. Soit la séquence : [Arg - Met - Asp - Asn - Z - Lys]. |
Conclusion D'après la composition en acides aminés, il reste 1 Leu. La séquence circulaire de l'hexapeptide est donc : [Arg - Met - Asp - Asn - Leu - Lys]. |
|