Structure macromolecule sequence peptide Degradation Edman Texte et corriges travaux diriges Enseignement et recherche Biochimie Emmanuel Jaspard Universite Angers biochimej

Étude d'un hexapeptide

Déterminez la séquence d'une hormone hexapeptidique d'après les résultats suivants en expliquant le raisonnement.

1. L'incubation du peptide avec le phénylisothiocyanate, réactif de la méthode de dégradation d'Edman, ne donne aucune réaction.
2. L'action de la trypsine donne 2 fragments I et II. I est Arg. Après hydrolyse par HCl, II est composé de : 2 Asp / 1 Met / 1 Leu / 1 Lys et 1 NH3. Après un cycle de dégradation d'Edman, un tétrapeptide et la PTH-Met sont libérés à partir de II.
3. La titration de l'hexapeptide de pH 1 à pH 13 nécessite 3 équivalents OH par mole de peptide et les pKa des groupes ionisables sont : 3,9 - 10,5 - 12,5.
4. Le traitement de l'hexapeptide par le bromure de cyanogène (BrCN) donne un seul peptide qui, après un cycle de dégradation d'Edman, libère le PTH-Asp.
5. Le traitement de l'hexapeptide par la protéase de staphylocoque (qui hydrolyse les peptides du côté C-terminal des résidus glutamyle et aspartyle) donne un peptide qui, après un cycle de dégradation d'Edman, libère la PTH-Asn.

1. Le phénylisothiocyanate (PITC) n'agit que sur une fonction aminée libre (primaire ou secondaire comme la proline). Le PITC est utilisé pour la quantification des acides aminés par HPLC lors de la dégradation d'Edman pour le séquençage des protéines.

phenylisothiocyanate PITC sequence peptide bromure de cyanogene homoserine lactone pyroglutamate degradation Edman biochimej

S'il n'y a pas de réaction avec le PITC, c'est que l'acide aminé N-terminal est bloqué. Beaucoup de séquences de protéines d'Eucaryotes sont protégées des aminopeptidases par un acide aminé en position N-terminale qui est bloqué.

Exemple de protection : acétylation et cyclisation de la glutamine N-terminale des immunoglobulines qui forme le pyroglutamate (ci-dessous). On trouve aussi le pyroglutamate dans la bactériorhodopsine, la ribonucléase (RNase 3).

glutamine pyroglutamate sequence peptide phenylisothiocyanate PITC bromure de cyanogene homoserine lactone degradation Edman biochimej

Voir : Liu et al. (2011) "N-terminal Glutamate to Pyroglutamate Conversion in Vivo for Human IgG2 Antibodies" J. Biol. Chem. 286, 11211 - 11217

Le pyroglutamate joue divers rôles physiologiques (neuropeptide, "thyrotropin-releasing hormone", cytokines, ...).
La pyroglutamate aminopeptidase (EC 3.4.19.3) décyclise le pyroglutamate et libère la fonction aminée N-terminale.

Autres exemples : l'acétylserine et la N-acétylthreonine sont 2 autres acides aminés bloqués.

Une autre possibilité, s'il n'y a pas de réaction avec le PITC, est que le peptide soit circulaire : ni acide aminé N-terminal, ni acide aminé C-terminal.

2. La trypsine (EC 3.4.21.4) hydrolyse la liaison peptidique après Arg et Lys sauf si ces acides aminés sont suivis par une proline. Cependant elle peut avoir une spécificité plus complexe.

On n'obtient que 2 fragments bien que l'hexapeptide contienne 1 Arg et 1 Lys et qu'il n'y ait pas de Pro.

Si l'hexapeptide est linéaire, l'un des deux acides aminés (Arg ou Lys) doit se trouver en position C-terminale. Il y a 2 séquences possibles : [Arg - Met - X - Y - Z - Lys] ou [Met - X - Y - Z - Lys - Arg] qui génèrent un acide aminé (Arg) plus PTH-Met libérée du peptide restant.

Cependant, puisque l'acide aminé N-terminal est bloqué (question N°1), celà confirme que l'hexapeptide est circulaire.

hydrolyse trypsine sequence peptide phenylisothiocyanate PITC bromure de cyanogene homoserine lactone pyroglutamate degradation Edman biochimej

3. Titration de l'hexapeptide

Hydrolyse totale acide	Hydrolyse totale alcaline
HCl 6 M - 110°C - 24h environ le tryptophane est détruit les fonctions amides de la glutamine et de l'asparagine donnent 1 molécule de NH3 et sont transformées en fonction carboxylique : on obtient respectivement le glutamate et l'aspartate	NaOH 4 M - 110°C - 24h environ la sérine, la thréonine, la cystéine et l'arginine sont détruites désamination partielle et racémisation des autres acides aminés l'hydrolyse totale acide est plus utilisée car elle détruit moins d'acides aminés
Remarque : ces techniques seront progressivement délaissées au profit du séquençage direct de la chaîne polypeptidique par spectrométrie de masse ou indirect par séquençage du génome puis traduction automatique in silico (bioinformatique).

La titration de l'hexapeptide donne :

1 équivalent OH -> pKa = 3,9

1 équivalent OH -> pKa = 10,5

1 équivalent OH -> pKa = 12,5

=> 1 Asp

Or la composition en acides aminés indique qu'il y a 2 Asp et 1 NH3.
Donc, l'un des 2 Asp provient de la transformation d'une Asn en [Asp + NH3] lors de l'hydrolyse acide pour la détermination de la composition en acides aminés.

=> 1 Lys

=> 1 Arg

4. Le bromure de cyanogène ("cyanogen bromide" - BrCN) réagit spécifiquement avec la méthionine et produit des peptides portant un résidu homosérine lactone à l'extrémité C-terminale.

On n'obtient qu'un peptide, ce qui confirme que l'hexapeptide est circulaire.

bromure cyanogene homoserine lactone sequence peptide phenylisothiocyanate PITC pyroglutamate degradation Edman biochimej

La libération du PTH-Asp (nouveau résidu en position N-terminale après action de BrCN) indique que X = Asp.

Soit la séquence : [Arg - Met - Asp - Y - Z - Lys].

5. Action de la protéase de staphylocoque

D'après la composition en acides aminés, il y a 1 Asp et pas de Glu. L'hexapeptidique étant circulaire, on obtient donc qu'un fragment.

protease staphylocoque sequence peptide phenylisothiocyanate PITC bromure de cyanogene homoserine lactone pyroglutamate degradation Edman biochimej

La libération du PTH-Asn (nouveau N-terminal après action de la protéase), indique que Y = Asn.

Soit la séquence : [Arg - Met - Asp - Asn - Z - Lys].

Conclusion

D'après la composition en acides aminés, il reste 1 Leu. La séquence circulaire de l'hexapeptide est donc : [Arg - Met - Asp - Asn - Leu - Lys].

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