Une protéine a été digérée par la protéase V8 qui hydrolyse spécifiquement la liaison peptidique après l'acide aminé Glu. Parmi les produits de digestions majeurs, deux ont été détectés après séparation par chromatographie de filtration sur gel : voir la figure.

1. Quel domaine de fractionnement caractérise le gel utilisé ?
2. Calculer la masse molaire de chacun des fragments.
3. La protéine est constituée de 65 acides aminés. Si l'on considère une masse molaire moyenne de 140 Da pour chaque acide aminé, à quelle position dans la séquence primaire se situe le site de digestion ?

Exercice N°2

Un mélange d'acide aminé contient Asp (D), Gly (G), Thr (T), Leu (L) et Lys (K). On sépare ce mélange par chromatographie d'échange de cations sur DOWEX-50. Le groupement fonctionnel de ce gel est : [-R-benzène- SO₃^-]. Les acides aminés interagissent avec le Dowex essentiellement par interaction électrostatique mais aussi (dans une moindre mesure) par interaction hydrophobe entre la chaîne latérale et le groupement benzène porté par le gel.

Par ailleurs, une estimation de la charge portée par une molécule ionisable à un pH donné est : Δp = pI - pH où pI est le point isoéléctrique, c'est-à-dire le pH où la charge nette de la molécule est nulle.

Quel est l'ordre d'élution des acides aminés de ce mélange quand on fait passer sur le gel un tampon citrate pH 3 ?  

Exercice N°3

La séquence en position C-terminale d'une protéine est obtenue par action de la carboxypeptidase Y :

• on prélève une fraction aliquote du milieu réactionnel à différents temps d'action de l'enzyme
• l'échantillon est traité par l'isothiocyanate de phényle (PITC)
• on sépare le phénylthiohydantoïne acide aminé (PTH - acide aminé) libéré par l'action de l'enzyme par chromatographie en phase reverse
• on trace la cinétique de libération des acides aminés : voir la figure

Commenter les techniques utilisées et déterminer la séquence C-terminale de cette protéine.

Exercice N°4

La calmoduline est une protéine ubiquitaire qui joue un rôle prépondérant chez tous les organismes dans la transduction du signal calcique.

• Cette protéine peut fixer 4 atomes de calcium et lors de cette fixation, la calmoduline change de conformation.
• Quand elle a adopté la nouvelle conformation, elle se fixe sur des enzymes cibles qui subissent à leur tour un changement de conformation qui les active.

La NAD kinase est l'une des enzymes cibles de la calmoduline. On a essayé de purifier cette enzyme à partir de deux types de matériau d'origine végétale par diverses méthodes chromatographiques dont les résultats sont présentés dans les figures ci-dessous (menus déroulants).

• Rappeler le principe de chaque type de chromatographie.
• Quelles fractions semblent les plus intéressantes à retenir pour continuer la purification de l'enzyme ?
• Quel(s) type(s) de chromatographie semble le mieux adapté à la purification de la NAD kinase ?