Séparation d'acides aminés
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1. Un mélange des acides aminés suivants est soumis à une électrophorèse sur papier à pH 3,9 : A, S, F, L, R, D, H. Quels acides aminés migrent vers l’anode ? Quels acides aminés migrent vers la cathode ?

2. Pourquoi les acides aminés de même charge se séparent-ils très légèrement au cours de l’électrophorèse (exemple : Gly vs. Leu) ?

3. Soit le mélange des acides aminés A, V, E, K, T à pH 6. Quel est le profil de migration après une électrophorèse sur papier ? Indiquez l’endroit du dépôt, l’anode, la cathode et les acides aminés éventuellement non séparés. Quel produit permet de révéler les acides aminés ?


Principe et utilisation de l'électrophorèse

L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers d'un gel (un polymère) sous l'effet d'un champ électrique.

Les molécules se déplacent vers le pôle de charge opposée à leur charge nette z, à une vitesse v proportionnelle à cette charge : v = E. z / f

  • E est la force du champ éléctrique
  • f est la force de friction
  • La séparation électrophorétique se fait donc en fonction du rapport [charge / masse].

La mobilité électrophorétique d'une molécule peut-être exprimée (de manière simplifiée) par la relation suivante :

  • mobilité électrophorétique = k . (pH - pI) / masse molaire de la molécule
  • pI est le point isoélectrique de la molécule.

Considérons une protéine de pI = 5 :

  • Si le pH du tampon utilisé pour la chromatographie est inférieur au pI de la protéine (zone bleue - figure ci-dessous), celle-ci est chargée positivement : il faut utiliser un échangeur de cations.
  • Si le pH du tampon utilisé pour la chromatographie est supérieur au pI de la protéine (zone rouge), celle-ci est chargée négativement : il faut utiliser un échangeur d'anions.

amino acid isoelectric point separation migration electrophoresis biochimej

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Les techniques d'électrophorèse de macromolécules biologiques permettent, entre autre :

Protéines

  • de déterminer le nombre de sous-unités d'une protéine et de déterminer leur masse molaire respective
  • d'évaluer le degré de purification d'une protéine
  • de séparer des protéines pour les révéler par la technique du Western blot (réaction avec un ou des anticorps)
  • de séparer des protéines sur des gels bi-dimensionnels (technique de départ en protéomique), selon 2 paramètres : le point isoélectrique (isoélectrofocalisation - IEF) puis la masse molaire (gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes).
  • ...

Acides nucléiques

  • de séquencer l'ADN
  • de déterminer la taille de fragments d'ADN
  • de séparer des acides nucléiques pour les analyser par la technique du Northen blot (ARN) ou du Southern blot (ADN)
  • d'établir le profil de restriction (hydrolyse par des enzymes de restriction) de fragments d'ADN
  • ...

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Question 1. Dans le cas du mélange d'acides aminés (A, S, F, L, R, D, H. ) soumis à une électrophorèse sur papier à pH 3,9.
Acide aminé pI charge à pH 3,9 sens migration
A 6 + cathode
S 5,7 + cathode
F 5,5 + cathode
L 6 + cathode
R 10,8 +++ cathode
D 2,9 - anode
H 7,6 ++ cathode
Remarque : selon les sources, les valeurs de pI ou de pKa diffèrent légèrement.

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Question 2. La séparation électrophorétique se fait en fonction du rapport charge / masse.

La glycine migre donc davantage que Leu car même si ces deux acides aminés ont la même charge, Gly a une chaîne latérale moins volumineuse, donc une masse molaire plus faible (Gly : 57.02 / Leu : 113.08).

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Question 3. Profil de séparation électrophorétique du mélange : A, V, E, K, T à pH 6.
Acide aminé pI charge à pH 6 sens migration
A 6 neutre ne migre pas
V 6 neutre ne migre pas
E 3,2 négatif anode
K 9,6 positif cathode
T 5,6 légèrement négatif légère migration anode

La ninhydrine permet de révéler les acides aminés.

  • Le pourpre de Ruhemann (λ = 570 nm) est la couleur caractéristique du produit de réaction des acides aminés colorés à la ninhydrine.
  • Exception faite de la proline et de l'hydroxyproline qui sont colorées en jaune (λ = 440 nm).

ninhydrine amino acid isoelectric point separation migration electrophoresis biochimej

Voir une animation de la migration électrophorètique d'un mélange d'acides aminés.

Nature et caractéristiques des chaînes latérales des acides aminés
Acide aminé code Nature de la chaîne latérale Caractéristiques pKa ionisation
alanine (Ala) A

aliphatique (hydrocarbure saturé)

Ala : groupe méthyle

Val, Leu & Ile : chaîne ramifiée

 

Ile contient 2 carbones asymétriques (4 stéréoisomères)

-----
valine (Val) V
leucine (Leu) L
isoleucine (Ile) I
proline (Pro) P

acide α-Iminé (groupe aminé secondaire) chaîne latérale liée à la fois au groupe α-carboxyle ET au groupe α-aminé

structure particulière qui impose des changements de direction de l'enchaînement des carbones α des chaînes polypeptidiques

-----
phénylalanine (Phe) F groupe aromatique
Phe : groupe phényl
Trp : noyau indole
Tyr : groupe phénol
absorbent la lumière UV (ce qui permet de mesurer la concentration d'une protéine en solution)
Phe : λ = 260 nm / Trp : λ = 278 nm
Tyr à pH 7 : λ = 273 - 277 nm
Tyr à pH 13 (ion phénolate) : λ = 293 - 297 nm
-----
tryptophane (Trp) W -----
tyrosine (Tyr) Y 10,5
méthionine (Met) M groupe méthylthioester Met et Cys sont des mercaptans -----
cystéine (Cys) C groupe thiol peut former un pont disulfure avec une autre cystéine 8,4
glycine (Gly) G atome d'hydrogène seul acide aminé non chiral et le plus petit -----
aspartate (Asp) D groupe carboxyle

souvent à la surface des protéines où ils établissent des liaisons hydrogène ou des ponts salins (solvant ou autres molécules)

3,9
glutamate (Glu) E 4,1
asparagine (Asn) N amides respective de Asp et Glu trés polaires
souvent à la surface des protéines (liaisons hydrogène)
-----
glutamine (Gln) Q -----
sérine (Ser) S

alcool aliphatique

groupe β - hydroxyle

réactif au sein des protéines, exemple : protéases à sérine non mesurable en solution aqueuse
thréonine (Thr) T 2 carbones asymétriques (4 stéréoisomères) -----
lysine (Lys) K bases azotées
Lys : groupe ε - aminé
Arg : ion guanidinium
His : noyau imidazole

souvent à la surface des protéines où ils établissent des liaisons hydrogène ou des ponts salins (solvant ou autres molécules

10,5
arginine (Arg) R 12
histidine (His) H réactif au sein des protéines, exemple :
protéases à sérine (catalyse acide base)
6,0
Voir le cours sur le métabolisme des acides aminés

 

Liens Internet
"Les propriétés acido-basiques des acides aminés" (Sorbonne - Université) Aller au site
"Proteins, Peptides & Amino Acids" Aller au site

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