1. Un mélange des acides aminés suivants est soumis à une électrophorèse sur papier à pH 3,9 : A, S, F, L, R, D, H. Quels acides aminés migrent vers l’anode ? Quels acides aminés migrent vers la cathode ?

2. Pourquoi les acides aminés de même charge se séparent-ils très légèrement au cours de l’électrophorèse (exemple : Gly vs. Leu) ?

3. Soit le mélange des acides aminés A, V, E, K, T à pH 6. Quel est le profil de migration après une électrophorèse sur papier ? Indiquez l’endroit du dépôt, l’anode, la cathode et les acides aminés éventuellement non séparés. Quel produit permet de révéler les acides aminés ?

Principe et utilisation de l'électrophorèse

L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers d'un gel (un polymère) sous l'effet d'un champ électrique.

Les molécules se déplacent vers le pôle de charge opposée à leur charge nette z, à une vitesse v proportionnelle à cette charge : v = E. z / f

• E est la force du champ éléctrique
• f est la force de friction
• La séparation électrophorétique se fait donc en fonction du rapport [charge / masse].

La mobilité électrophorétique d'une molécule peut-être exprimée (de manière simplifiée) par la relation suivante :

• mobilité électrophorétique = k . (pH - pI) / masse molaire de la molécule
• où pI est le point isoélectrique de la molécule.

Considérons une protéine de pI = 5 :

• Si le pH du tampon utilisé pour la chromatographie est inférieur au pI de la protéine (zone bleue - figure ci-dessous), celle-ci est chargée positivement : il faut utiliser un échangeur de cations.
• Si le pH du tampon utilisé pour la chromatographie est supérieur au pI de la protéine (zone rouge), celle-ci est chargée négativement : il faut utiliser un échangeur d'anions.

Les techniques d'électrophorèse de macromolécules biologiques permettent, entre autre :

Protéines

• de déterminer le nombre de sous-unités d'une protéine et de déterminer leur masse molaire respective
• d'évaluer le degré de purification d'une protéine
• de séparer des protéines pour les révéler par la technique du Western blot (réaction avec un ou des anticorps)
• de séparer des protéines sur des gels bi-dimensionnels (technique de départ en protéomique), selon 2 paramètres : le point isoélectrique (isoélectrofocalisation - IEF) puis la masse molaire (gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes).
• ...

Acides nucléiques

• de séquencer l'ADN
• de déterminer la taille de fragments d'ADN
• de séparer des acides nucléiques pour les analyser par la technique du Northen blot (ARN) ou du Southern blot (ADN)
• d'établir le profil de restriction (hydrolyse par des enzymes de restriction) de fragments d'ADN
• ...

Question 2. La séparation électrophorétique se fait en fonction du rapport charge / masse.

La glycine migre donc davantage que Leu car même si ces deux acides aminés ont la même charge, Gly a une chaîne latérale moins volumineuse, donc une masse molaire plus faible (Gly : 57.02 / Leu : 113.08).

La ninhydrine permet de révéler les acides aminés.

• Le pourpre de Ruhemann (λ = 570 nm) est la couleur caractéristique du produit de réaction des acides aminés colorés à la ninhydrine.
• Exception faite de la proline et de l'hydroxyproline qui sont colorées en jaune (λ = 440 nm).

Voir une animation de la migration électrophorètique d'un mélange d'acides aminés.