1. Formation du glutamate par la glutamate déshydrogénase (E.C. 1.4.1.4)

2. Formation de la glutamine à partir du glutamate par la glutamine synthétase (E.C. 6.3.1.2)

3. Le couple glutamine synthétase - GOGAT (EC 1.4.1.13)

4. Régulation de l'activité de la glutamine synthétase

4a. Rétro - inhibition cumulative de la glutamine synthétase

4b. Régulation de l'activité de la glutamine synthétase : adénylyltransferase, protéine PII et uridylyltransferase

5. La glutamine synthétase des plantes

6. Liens internet et références

20 acides aminés (les plus courants - on en recense plus de 350) constituent les protéines. On pourrait s'attendre à un grand nombre de voies de biosynthèse de ces composés.

La cellule a adopté une stratégie qui repose sur des mécanismes communs à plusieurs acides aminés : ainsi, l'on a des branchements à partir d'un intermédiaire commun.

Par ailleurs, les acides aminés ont pour précurseurs des métabolites issus des grandes voies métaboliques comme : la glycolyse, le cycle des acides tricarboxyliques, la voie des pentoses phosphate.

(e) : acides aminés essentiels - (ne) : acides aminés non essentiels

1. Formation du glutamate par la glutamate déshydrogénase E.C. 1.4.1.4

On peut considérer l'assimilation de NH₄⁺ par la glutamate déshydrogénase E.C. 1.4.1.4 (GDH4) comme un point d'entrée dans la synthèse des acides aminés.

• cette réaction (figure ci-dessous) correspond à la condensation d'ammoniac avec le groupe carbonyle de l'α-cétoglutarate (2-oxoglutarate) pour former un intermédiaire α-iminium glutarate qui est fixé temporairement à l'enzyme pour être ensuite réduit en glutamate
• le pKa de l'ammoniac est de 9,2 et il existe donc sous forme d'ion ammonium NH₄⁺ au pH physiologique
• cependant c'est la forme déprotonnée NH₃ (qui est fortement nucléophile du fait du doublet porté par l'atome d'azote) qui est l'espèce réactionnelle

Selon les organismes, cette réaction est catalysée principalement dans un sens ou dans l'autre et utilise une coenzyme particulière :

• chez les animaux, il y a essentiellement synthèse de l'α-cétoglutarate avec utilisation du NADH : les isoformes de la glutamate déshydrogénase sont E.C. 1.4.1.2 et E.C. 1.4.1.3
• chez les plantes et les microorganismes, il y a essentiellement synthèse du glutamate avec utilisation du NADPH

Voir la structure hypothétique de la glutamate déshydrogénase EC 1.4.1.4

2. Formation de la glutamine à partir du glutamate par la glutamine synthétase

La seconde réaction clé dans l'assimilation d'ammoniac correspond à la formation de glutamine à partir de glutamate et d'ammoniac, réaction catalysée par la glutamine synthétase (GS - EC 6.3.1.2).

• cette réaction (figure ci-dessous) illustre le couplage de l'hydrolyse de l'ATP à la biosynthèse d'une molécule
• le carboxylate du glutamate est phosphorylé par l'ATP en γ-glutamyl phosphate, qui est beaucoup plus réactif que le glutamate
• l'attaque du groupement phosphate par un puissant nucléophile comme l'atome d'azote porté par l'ammoniac aboutit à la formation de la glutamine

3. Le couple glutamine synthétase - GOGAT

GOGAT (EC 1.4.1.13) = [NADPH-dependent glutamine:2-oxoglutarate amidotransferase] ou glutamate synthase.

Les données expérimentales, obtenues notamment chez les plantes, sont en faveur d'une synthèse du glutamate, non pas par la glutamate déshydrogénase EC 1.4.1.4, mais par le couple GS - GOGAT :

• GS : NH3 + glutamate + ATP -> glutamine + ADP + Pi
• GOGAT : glutamine + α-cétoglutarate + NADPH + H⁺ -> 2 glutamate + NADP⁺

Voir une simulation de l'activité du couple GS - GOGAT : "Computer Simulation of Metabolism Consideration of Cycles - The GS/GOGAT Cycle"

4. Régulation de l'activité de la glutamine synthétase

4a. Rétro - inhibition cumulative de la glutamine synthétase

Escherichia coli ne possède qu'une forme de GS codée par le gène glnA.

La GS de Escherichia coli est un excellent exemple pour souligner la régulation à laquelle sont soumises la plupart des enzymes qui interviennent dans la synthèse des acides aminés.

En effet cette enzyme est un oligomère de 12 sous-unités identiques qui porte chacune non seulement un site actif mais également des sites de fixation d'inhibiteurs allostériques :

• parmi ces inhibiteurs, six possèdent un atome d'azote qui provient du groupement aminé de la glutamine
• par ailleurs, l'effet inhibiteur est additif, le degré d'inhibition étant d'autant plus élevé que le nombre d'inhibiteur fixé est grand: il s'agit là de rétro-inhibition cumulative

Source : "Principe de Biochimie" Horton et al. (1994) Ed. DeBoeck Université

On comprend plus aisément l'extrême sophistication de la GS en regard des divers rôles de la glutamine au sein de la cellule :

• d'une part la formation de la glutamine permet l'assimilation d'un nouvel atome d'azote
• en second lieu cet atome d'azote du groupement amide porté par la chaîne latérale est le précurseur direct de plusieurs atomes d'azote contenus dans les noyaux des bases puriques et pyrimidiques

4b. Régulation de l'activité de la glutamine synthétase : adénylyltransférase, protéine PII et uridylyltransférase

Chez un grand nombre de bactéries, l'activité de la GS est finement régulée par une adénylyltransférase ou ATase.

L'ATase (EC 2.7.7.42) catalyse la réaction : 12 ATP + GS <=> 12 PP_i + GS-(AMP)₁₂

• le groupement adénylyle est fixé de manière covalente à la tyrosine 397 de la GS (Berlett et al., 1998)
• chez Escherichia coli, cette inactivation est réversible puisque l'ATase catalyse la désadénylylation (Caban and Ginsburg, 1976)
• la GS de Escherichia coli étant composée de 12 sous-unités identiques, tous les degrés d'adénylylation existent : l'activité catalytique de la GS est inversement proportionnelle au nombre de groupement adénylyle fixé
• la forme adénylylée de la GS est inactive parce qu'elle est plus sensible à la rétro-inhibition cumulative (voir ci-dessus) par les produits terminaux du métabolisme de la glutamine

L'ATase existe sous 2 formes : l'ATase A (AT en orange dans le shéma ci-dessous) qui adénylyle la GS et l'ATase D qui la désadénylyle (AT en bleu) :

Source : "Regulation of the activity of E. coli glutamine synthetase"

• l'interconversion de ces 2 formes d'ATase est contrôlée par une protéine appelée PII
• la protéine PII existe elle aussi sous 2 formes : PII <=> PII-UMP
• l'uridylylation (incorporation d'UMP) de PII est catalysée par une uridylyltransférase (UT en gris)
• l'activité de l'UT est elle-même sous le contrôle d'effecteurs allostériques comme l'α-cétoglutarate (inhibiteur) et la glutamine ou l'ATP (activateurs). Quand le taux d'ammonaic est élevé, celui de la glutamine l'est aussi et celui de l'α-cétoglutarate est faible : l'ATase A adénylyle alors la GS, ce qui l'inactive

5. La glutamine synthétase des plantes

La glutamine synthétase des plantes supérieures est octamèrique. Les sous-unités sont d'environ 40 kDa.

Contrairement aux bactéries, il existe différentes isoformes de GS chez les plantes supérieures : une GS cytosolique GS1, une GS chloroplastique GS2 et une GS des nodules de racines GSN.

La famille des gènes codant la GS chez les plantes est complexe.

L'isoforme de GS des feuilles de Phaseolus vulgaris résulte de l'expression différentielle de 3 membres de cette famille multigènique (figure ci-dessous - Lea et al, 1989) :

• les gènes gln-a et gln-b codent la GS cytosolique riche en résidus alanine (Baima et al, 1989; Cock et al, 1991)
• le gène gln-d code la GS2 chloroplastique. Les ARM messagers de la GS2 s'accumulent lors du traitement à la lumière et au cours de la photorespiration. La GS2 chloroplastique contient 2 résidus cystéine supplémentaires par sous-unité (Stewart et al, 1980). Ces cystéines se trouvent dans le site potentiel de fixation des substrats
• le gène gln-g est fortement exprimé lors du développement des nodules. L'expression de ce gène est régulé par la photorespiration
• le produit de l'expression du gène gln-e n'est pas bien caractérisé

6. Liens internet et références

Site web : "Ammonia Assimilation and Recycling - Regulation of glutamine synthetase - Bacteria and Cyanobacteria"

Berlett et al. (1998) "Carbon dioxide stimulates peroxynitrite-mediated nitration of tyrosine residues and inhibits oxidation of methionine residues of glutamine synthetase: both modifications mimic effects of adenylylation" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2784-2789

Caban & Ginsburg (1976) "Glutamine synthetase adenylyltransferase from Escherichia coli: purification and physical and chemical properties" Biochemistry 15, 1569-1580

Stewart et al. (1980) "Enzymes of glutamate formation: glutamate dehydrogenase, glutamine synthetase, and glutamate synthase". In BJ Miflin ed "The Biochemistry of Plants", Vol 5, Academic Press, New York, 271-327

Baima et al. (1989) "Characterization of a cDNA clone for barley leaf glutamine synthetase" Carlsberg Res. Commun. 54, 1-9

Cock et al. (1991) "A nuclear gene with many introns encoding ammonium-inducible chloroplastic NADP-specific glutamate dehydrogenase(s) in Chlorella sorokiniana" Plant Mol. Biol. 17, 1023-1044

Lea et al. (1989) "The use of mutants lacking glutamine synthetase and glutamate synthase to study their role in plant nitrogen metabolism". In JE Poulton, JT Romeo, EE Conn eds "Plant Nitrogen Metabolism", Recent Advances in Phytochemistry Vol 23. Plenum Press, New York, 157-189