Exercice 1

Soit une cellule d'un volume de 10³ µm³ avec une concentration totale de protéines = 5 µM :

• Combien de molécules de protéines y a-t-il dans cette cellule ?
• Combien de molécules de protéines d'un type donné y a-t-il si l'on considère qu'il y a 10.000 types différents de protéines dans cette cellule ?
• Le nombre d'Avogadro (N) est le nombre d'atomes ou de molécules dans une mole de matière = 6,022 10²³ mol^-1.

Exercice 2

Aller au site "STRING exercises" : faire l'exercice 1.

Exercice 3 - 1ère partie

• Aller à HPIDB.
• "Search Database By" => choisir "Keyword". Menu "Query Type" : choisir "Protein Accession / Name" => entrer "Q16543".
• Page de résultats : cliquer sur "Network visualisation". Choisir "By taxon Names" dans le menu déroulant.

a. Qu'est-ce que Q16543 ?

b. Quelle(s) protéine(s) du virus de la Dengue interagit/ssent avec l'homme ?

Exercice 3 - 2ème partie

Revenir à la page de résultats de HPIBD : cliquer sur "Download unique proteins from Cytoscape (tab delimited)"=> un fichier au format ".tsv" doit être téléchargé.

Lancer le programme Cytoscape (s'il est disponible) : Onglet "File" => menu "Import" => choisir "Network from File ..." : ouvrir le fichier récupéré de HPIBD.

Une fenêtre s'ouvre pour attribuer chaque colonne de ce fichier à un objet du graphe :

• Colonne "HPI_Host_Protein" => attribuer "Source Node" (rond vert)
• Colonne "HPI_Host_Taxon" => attribuer "Not Imported" (rond barré)
• Colonne "HPI_Pathogen_Protein" => attribuer "Target Node" (rond rouge - point central)
• Colonne "HPI_Pathogen_Taxon" => attribuer "Target Node Attribute" (fichier rouge)

a. Le réseau d'interactions créé avec Cytoscape a-t-il le même aspect (noeuds, arrêtes, attributs) que celui de HPIDB ?

b. Se familiariser avec certains outils du programme :

• La loupe du zoom.
• Cliquer sur un noeud quelconque puis sur l'icône "deux maison" ("First Neighbors of Selected Nodes").

c. Voir le paragraphe "6. Quelques ressources pour utiliser Cytoscape".

Modifier l'aspect du réseau avec les options du menu général "Layout". Par exemple :

• Modifier l'aspect avec les outils du sous-menu "Layout tools".
• Modifier le type de graphe avec "Grid Layout", "Hierarchical Layout", "Circular Layout", "Stacked Node Layout".
• Tester d'autres options à loisir ...

d. Voir le tutoriel Cytoscape pour modifier l'aspect des noeuds et des arêtes : "Set Node Fill Color".

• Entrer dans le sous-menu le menu "Style" de Cytoscape tout à gauche de la fenêtre.
• Modifier les couleurs des noeuds, modifier l'aspect des arêtes, ...

Exercice 4

Voir le paragraphe "4. Démarche pour la construction de réseaux d'interactions".
Aller à l'exercice en ligne de l'EBI sur l'interactomique : remplir la matrice d'ajacence du graphe proposé.

Exercice 5

Analyser le paragraphe "Identification of existing drugs targeting SARS-CoV-2 human host factors" et la Figure 5 de l'article Gordon et al. (2020) "A SARS-CoV-2 Protein Interaction Map Reveals Targets for Drug-Repurposing" Nature 583, 459 – 468.

Des ligands interagissant avec certaines protéines humaines ont été recherchés afin de perturber l'interactome entre ces protéines et celles du virus SARS-CoV-2.

Les molécules ont été classées par ordre de priorité en fonction :

• De la signification statistique de l'interaction [protéines humaines - protéines virales].
• De leur statut en tant que médicament : (i) médicament approuvé ; (ii) nouveau médicament expérimental (IND : "clinique") ; (iii) candidat préclinique.
• De leur sélectivité.
• De leur disponibilité.

Source : Figure 5 "Drug-human target network" - Gordon et al. (2020)

• Les recherches chimio-informatiques sur les interactions humaines dans le "Guide de pharmacologie" IUPHAR/BPS (2020-3-12) et dans la base de données ChEMBL25 ont révélé 16 médicaments approuvés (en vert), 3 nouveaux médicaments expérimentaux (test cliniques, en jaunes) et 18 candidats précliniques (en violet).
• La recherche bibliographique spécifique de la cible et de la voie a révélé 13 médicaments approuvés, 9 nouveaux médicaments expérimentaux (test cliniques) et 10 candidats précliniques.

Sur les 332 cibles humaines qui interagissent avec les protéines d'appât viral avec une signification élevée, 63 cibles possèdent 69 [médicaments/IND/molécules précliniques] qui les modulent et sont intégrées au réseau d'interactions protéiques.

Parmi ces molécules, des ligands des récepteurs sigma1 et sigma2 ont été testés : halopéridol, PB28, PD-144418 et hydroxychloroquine (essais cliniques chez des patients atteint par la COVID-19).

La zotatifine (IC₉₀ = 37 nM) et PB28 (IC₉₀ = 278 nM) inhibent puissamment le virus SARS-CoV-2 :

• La zotatifine est un inhibiteur sélectif du facteur d'initiation de la traduction eucaryote 4A (eIF4A).
• Le PB28 (classe des tétralines) est un agoniste des récepteurs sigma 2 (K_I = 0,68 nM).
• Par ailleurs, PB28 est environ 20 fois plus puissant que l'hydroxychloroquine (IC₉₀ = 5780 nM).

Exercice 6

a. Analyser la figure 3 de l'article Reys & Labesse (2022) "SLiMAn: An Integrative Web Server for Exploring Short Linear Motif-Mediated Interactions in Interactomes".

De très nombreuses interactions protéine-protéine impliquent des domaines qui contiennent des motifs appelés "motifs linéaires courts" ("Short Linear Motifs" - SLiM) :

• Ces motifs sont situés fréquemment dans des régions ou des boucles désordonnées (IDR/IPR).
• La longueur en acides aminés réduite et la faible conservation de leurs séquences, de même que leur nature intrinsèquement non structurée, rendent difficile la détection des SLiM.
• Le serveur Web SLiMAn ("Short Linear Motif Analysis") permet d'analyser des données d'interactomique.

La figure ci-dessous représente 4 réseaux incluant 13 protéines (mentionnées dans la base de données BioGRID) qui interagissent avec la protéine FRAT2 .

Source : Reys & Labesse (2022)

FRAT2 inhibe la protéine-kinase GSK-3 ("Glycogen Synthase Kinase-3") et régule positivement la voie de signalisation Wnt en stabilisant la β-caténine grâce à l'association avec GSK-3.

Réseau A : généré avec les données d'interactions de la base de données d'interactions STRING.

Réseau B : Idem à partir de la base de données Interactome3D.

Réseau C : Idem à partir de la base de données Proteo3DNet.

• La ligne épaisse traduit l'interaction domaine - domaine [ERB2-EGFR].
• La ligne pointillée rose traduit l'interaction [ERB2-XPO1] basée sur la prédiction avec l'algorithme ELM.
• Les lignes pointillées bleues traduisent les interactions liées à la phosphorylation des protéines basée sur la prédiction avec ELM.

Réseau D : Idem à partir de la base de données SLiMAn.

• Ligne pointillée rose : interaction [FRAT2-XPO1] avec un niveau de confiance élevé.
• Lignes pointillées bleues : interaction basée sur les phosphorylations par GSK3β avec un niveau de confiance faible.

ELM ("Extreme Learning Machines") : algorithme d'apprentissage machine qui attribue de manière aléatoire tous les paramètres cachés des nœuds de réseaux appelés "réseau à action directe à une seule couche cachée" ("Single-hidden Layer Feed-forward Networks" - SLFN) et calcule les poids de sortie des SLFN.

b. Aller à BioGRID.

• Combien de protéines interagissent avec FRAT2 de l'homme ?
• Pourquoi le chiffre est-il différent de celui de l'article ?

Réponses : 26 protéines. Les données de l'article sont antérieures à 06/2022 (date de publication de l'article).

Exercice 7 - "Single-Cell"

Analyser et décrire la figure 1 de l'article Clark et al. (2023) "Microfluidics-free single-cell genomics with templated emulsification" Nat. Biotechnol. 41, 1557 - 1566

La technique de séquençage instantané par répartition des particules ("Particle-templated instant partition sequencing" - PIP-seq) permet l'encapsulation de cellules dans des gouttelettes en utilisant la taille de billes pour contrôler le volume des gouttelettes : contrairement à la microfluidique, le nombre de gouttelettes évolue en fonction du volume total du récipient, et non du temps d'émulsification.

Cette technique permet ainsi de traiter des milliers d'échantillons ou des millions de cellules en quelques minutes.

Par exemple, avec un taux de collision de 6% incluant les doublets de cellules et la réutilisation des codes-barres, l'émulsification à base de particules dans des tubes de différents volumes génère des émulsions monodispersées capables de coder par codes-barres (figure du haut ci-dessous) :

• 3.500 cellules avec 35 µl d'hydrogel à codes-barres dans un tube de 500 µl.
• 225.000 cellules avec 2 ml d'hydrogel à codes-barres dans un tube de 15 ml.
• 1 million de cellules avec 10 ml d'hydrogel à codes-barres dans un tube de 50 ml.

La technique PIP-seq est également adaptable aux formats de plaques à 96, 384 et 1536 puits (figure du bas).

Source : Clark et al. (2023)

Exercice 9

a. Analyser le paragraphe "2.2. Protein Enrichment Analysis" et la Figure 2 de l'article Chiaradia et al. (2019) "Proteome Alterations in Equine Osteochondrotic Chondrocytes" Int. J. Mol. Sci. 20, 6179

b. Partie "Materials and Methods" => paragraphe "4.4. Protein Enrichment Analysis" : quelles sont les 2 bases de données et les 2 applications ("plugins") de Cytoscape utilisés pour analyser les réseaux regroupés sur la base de la fonction des protéines dérégulées dans OC ?

Réponse :

• 2 bases de données STRING et Panther
• Les "plugins" CluePedia et ClueGO

ClueGO permet de visualiser les termes biologiques non redondants pour de grands groupes de gènes dans un réseau fonctionnellement regroupé.

• A partir des sources d'ontologies utilisées, les termes sont sélectionnés selon différents critères de filtrage.
• Les termes apparentés qui partagent des gènes associés similaires peuvent être fusionnés pour réduire la redondance.

CluePedia permet de rechercher de nouveaux marqueurs potentiellement associés à des voies ("pathways").

• CluePedia calcule les dépendances statistiques linéaires et non linéaires à partir de données expérimentales.
• Les gènes, les protéines et les miARN liés sur la base d'informations in silico et/ou expérimentales sont intégrés dans un réseau avec les termes/voies ClueGO.

c. Quelles informations ontologiques et quelles ressources ont permis d'enrichir les réseaux ?

Réponse : les processus biologiques, les fonctions moléculaires, le composant cellulaire, la base de données Reactome, les annotations de KEGG et de WikiPathways.

d. Quels sont les groupes fonctionnels les plus importants ?

Réponse : la glycolyse et la gluconéogenèse, le développement de la plaque de croissance et du cartilage, la régulation positive de l'import de protéines, l'activité du médiateur de l'adhésion cellule-cellule et le nucléoïde mitochondrial.

Exercice 10 - facultatif

a. Aller aux réseaux analysables en ligne de NDEX.
Choisir l'exemple "PANCREATIC BETA CELL" : Analyser les résultats.

b. Ouvrir l'application Cytoscape.

• Revenir à la page du réseau NDEX : cliquer sur l'icône orange (en haut à droite) pour ouvrir le réseau dans l'aplication Cytoscape.
• Interpréter les différences d'aspects des réseaux.