Exercice 1

Soit une cellule d'un volume de 10³ µm³ avec une concentration totale de protéines = 5 µM :

• Combien de molécules de protéines y a-t-il dans cette cellule ?
• Combien de molécules de protéines d'un type donné y a-t-il si l'on considère qu'il y a 10.000 types différents de protéines dans cette cellule ?
• Le nombre d'Avogadro (N) est le nombre d'atomes ou de molécules dans une mole de matière = 6,022 10²³ mol^-1.

Exercice 2

Aller au site "STRING exercises" : faire l'exercice 1.

Coller "INSR" dans la fenêtre "Protein Name" et choisir "Homo sapiens". Puis "SEARCH" puis "CONTINUE".

Analyser le réseau créé en explorant les options des différentes fenêtres en bas. En particulier :

• "Legends" pour comprendre les symboles, les couleurs et la signification de la représentation.
• "Settings" => "full STRING network" vs. "physical subnetwork"; "evidence" vs. "confidence"
• Interpréter les données dans "Analysis", en particulier les données d'ontologie "Functional enrichments in your network".
• Créer des sous-groupes en modifiant les paramètres "Clustering Options" de la fenêtre "Clusters".

Exercice 3 : représentation de réseau avec Cytoscape

a. Aller aux réseaux analysables en ligne de NDEX. Choisir l'exemple "PANCREATIC BETA CELL" [passer "Skip" & "Got it"].

Qu'est-ce que STAT3 ?

• STAT3 ("Signal transducer and activator of transcription 3") est un membre de la famille des facteurs de transcription STAT.
• C'est une protéine impliquée dans la transduction de signal. Elle active la transcription en médiant les réponses cellulaires aux interleukines et autres facteurs de croissance.

b. Trouver un article scientifique décrivant un lien entre STAT3 et FOXA2.

Tang et al. (2024) "Mediation of FOXA2/IL-6/IL-6R/STAT3 signaling pathway mediates benzo[a]pyrene-induced airway epithelial mesenchymal transformation in asthma" Environmental Pollution 357, 124384

Le benzo[a]pyrène (BaP) est un polluant toxique qui augmente l'incidence et la gravité de l'asthme. Après action du BaP :

• La transcription de FOXA2 dans les poumons de souris asthmatiques diminue. FOXA2 ("Forkhead box protein A2") est un facteur de transcription de la sous-famille "Forkhead box" - FOX.
• La production et la sécrétion de la cytokine interleukine-6 (IL-6) sont stimulées.
• La phosphorylation de STAT3 et sa translocation dans le noyau augmentent.
• Ces effets entraînent des modifications des marqueurs de la transition épithélio-mésenchymateuse ("epithelial-to-mesenchymal transition") ou TME.

Le BaP active la voie de signalisation [IL-6 / IL-6R (récepteur de l'interleukine 6 / STAT3] pour favoriser la TME des voies respiratoires dans l'asthme.

Source : Tang et al. (2024)

Autre article : Hao et al. (2014) "Mycoplasma pneumoniae Modulates STAT3-STAT6/EGFR-FOXA2 Signaling To Induce Overexpression of Airway Mucins" Infect. Immun. 82, 5246 - 5255

c. Revenir à la page de NDEX. Cliquer sur l'icône orange (en haut à droite) pour ouvrir le réseau dans l'application Cytoscape.

On peut afficher le réseau dans une fenêtre séparée en cliquant sur l'icône "Detach View" (flèche blanche vers le haut dans un petit cadre noir, en bas de la fenêtre qui affiche le réseau).

• Voir le paragraphe "6. Quelques ressources pour utiliser Cytoscape".
• Tutoriel Cytoscape pour modifier l'aspect des noeuds et des arêtes : "Set Node Fill Color".

d. Cliquer sur le noeud "STAT3" puis sur l'icône "deux maison" ("First Neighbors of Selected Nodes") en haut.

Déterminer les plus proches voisins de STAT3 : SHH, SOX2, FGF8, FOXA2 et MSX1.

e. Regroupement des nœuds

• Avec la touche "cmd" (Mac) ou touche "Maj" (PC), sélectionner tous les nœuds (rectangles de la colonne) du sous-réseau "Regionalisation" : ils sont surlignés en jaune.
• Avec un "clic droit" ouvrir le menu "Group -> Group Selected Nodes" et attribuer le nom "Regionalisation" au groupe créé.
• Puis faire un "double-clic" sur l'un des nœuds jaunes pour tous les regrouper en un seul qui affiche le nom choisi.
• On restaure le sous-réseau dégroupé avec un "double-clic" sur le nœud.

Recommencer avec les 3 autres sous-réseaux (nœuds en colonnes) du réseau.

f. Modification de l'apparence du réseau

• Ouvrir l'onglet vertical "Style" (icône "pinceau" tout à gauche).
• Ouvrir le menu "WP2855 – Dopaminergic neurogenesis - Homo sapiens-Style" : choisir "Default" ou "Gradient1" (par exemple) ou tout autre selon l'inspiration.
• Sélectionner la fenêtre "Node" (tout en bas). Avec les valeurs des paramètres de la colonne "Default", modifier l'apparence des nœuds (couleur, encadrement, épaisseur du trait, largeur du cadre, ...).
• Sélectionner la fenêtre "Edge" (tout en bas) et modifier les arrêtes entre les nœuds (flèche ou autre).
• Sélectionner la fenêtre "Network" (tout en bas) et modifier le fond de l'image ("Background paint").

Essayer de reproduire un réseau ayant une apparence comme ceux présentés en exemple ci-dessous (1er = "Default" / 2è = "Gradient1" ) ou toute autre apparence selon l'inspiration).

Sauvegarder la figure au format et à la taille désirés avec le menu .

Exercice 4

Voir le paragraphe "4. Démarche pour la construction de réseaux d'interactions".

Aller à l'exercice en ligne de l'EBI sur l'interactomique : remplir la matrice d'adjacence ("the adjacency matrix") du graphe proposé.

Exercice 5

Analyser le paragraphe "Identification of existing drugs targeting SARS-CoV-2 human host factors" et la Figure 5 de l'article Gordon et al. (2020) "A SARS-CoV-2 Protein Interaction Map Reveals Targets for Drug-Repurposing" Nature 583, 459 – 468.

Des ligands interagissant avec certaines protéines humaines ont été recherchés afin de perturber l'interactome entre ces protéines et celles du virus SARS-CoV-2.

Les molécules ont été classées par ordre de priorité en fonction :

• De la signification statistique de l'interaction [protéines humaines - protéines virales].
• De leur statut en tant que médicament : (i) médicament approuvé ; (ii) nouveau médicament expérimental (IND : "clinique") ; (iii) candidat préclinique.
• De leur sélectivité.
• De leur disponibilité.

Source : Figure 5 "Drug-human target network" - Gordon et al. (2020)

• Les recherches chimio-informatiques sur les interactions humaines dans le "Guide de pharmacologie" IUPHAR/BPS (2020-3-12) et dans la base de données ChEMBL25 ont révélé 16 médicaments approuvés (en vert), 3 nouveaux médicaments expérimentaux (test cliniques, en jaunes) et 18 candidats précliniques (en violet).
• La recherche bibliographique spécifique de la cible et de la voie a révélé 13 médicaments approuvés, 9 nouveaux médicaments expérimentaux (test cliniques) et 10 candidats précliniques.

Sur les 332 cibles humaines qui interagissent avec les protéines d'appât viral avec une signification élevée, 63 cibles possèdent 69 [médicaments/IND/molécules précliniques] qui les modulent et sont intégrées au réseau d'interactions protéiques.

Parmi ces molécules, des ligands des récepteurs sigma1 et sigma2 ont été testés : halopéridol, PB28, PD-144418 et hydroxychloroquine (essais cliniques chez des patients atteint par la COVID-19).

La zotatifine (IC₉₀ = 37 nM) et PB28 (IC₉₀ = 278 nM) inhibent puissamment le virus SARS-CoV-2 :

• La zotatifine est un inhibiteur sélectif du facteur d'initiation de la traduction eucaryote 4A (eIF4A).
• Le PB28 (classe des tétralines) est un agoniste des récepteurs sigma 2 (K_I = 0,68 nM).
• Par ailleurs, PB28 est environ 20 fois plus puissant que l'hydroxychloroquine (IC₉₀ = 5780 nM).

Exercice 6

a. Analyser la figure 3 de l'article Reys & Labesse (2022) "SLiMAn: An Integrative Web Server for Exploring Short Linear Motif-Mediated Interactions in Interactomes".

De très nombreuses interactions protéine-protéine impliquent des domaines qui contiennent des motifs appelés "motifs linéaires courts" ("Short Linear Motifs" - SLiM) :

• Ces motifs sont situés fréquemment dans des régions ou des boucles désordonnées (IDR/IPR).
• La longueur en acides aminés réduite et la faible conservation de leurs séquences, de même que leur nature intrinsèquement non structurée, rendent difficile la détection des SLiM.
• Le serveur Web SLiMAn ("Short Linear Motif Analysis") permet d'analyser des données d'interactomique.

La figure ci-dessous représente 4 réseaux incluant 13 protéines (mentionnées dans la base de données BioGRID) qui interagissent avec la protéine FRAT2.

FRAT2 inhibe la protéine-kinase GSK-3 ("Glycogen Synthase Kinase-3") et régule positivement la voie de signalisation Wnt en stabilisant la β-caténine grâce à l'association avec GSK-3.

Source : Reys & Labesse (2022)

Réseau A : généré avec les données d'interactions de la base de données d'interactions STRING.

Réseau B : Idem à partir de la base de données Interactome3D.

Réseau C : Idem à partir de la base de données Proteo3DNet.

• La ligne épaisse traduit l'interaction domaine - domaine [ERB2-EGFR].
• La ligne pointillée rose traduit l'interaction [ERB2-XPO1] basée sur la prédiction avec l'algorithme ELM.
• Les lignes pointillées bleues traduisent les interactions liées à la phosphorylation des protéines basée sur la prédiction avec ELM.
  • ELM ("Extreme Learning Machines") : algorithme d'apprentissage machine.
  • Il attribue de manière aléatoire tous les paramètres cachés des nœuds de réseaux appelés "réseau à action directe à une seule couche cachée" ("Single-hidden Layer Feed-forward Networks" - SLFN) et calcule les poids de sortie des SLFN.

Réseau D : Idem à partir de la base de données SLiMAn.

• Ligne pointillée rose : interaction [FRAT2-XPO1] avec un niveau de confiance élevé.
• Lignes pointillées bleues : interaction basée sur les phosphorylations par GSK-3β avec un niveau de confiance faible.

b. Aller à BioGRID.

• Combien de protéines interagissent avec FRAT2 de l'homme ?
• Pourquoi le chiffre est-il différent de celui de l'article ?

Réponses : 26 protéines. Les données de l'article sont antérieures à 06/2022 (date de publication de l'article).

Exercice 7 - "Single-Cell"

Analyser et décrire la figure 1 de l'article Clark et al. (2023) "Microfluidics-free single-cell genomics with templated emulsification" Nat. Biotechnol. 41, 1557 - 1566

La technique de séquençage instantané par répartition des particules ("Particle-templated instant partition sequencing" - PIP-seq) permet l'encapsulation de cellules dans des gouttelettes en utilisant la taille de billes pour contrôler le volume des gouttelettes :

• Contrairement à la microfluidique, le nombre de gouttelettes évolue en fonction du volume total du récipient, et non du temps d'émulsification.
• Cette technique permet ainsi de traiter des milliers d'échantillons ou des millions de cellules en quelques minutes.

Par exemple, avec un taux de collision de 6% incluant les doublets de cellules et la réutilisation des codes-barres, l'émulsification à base de particules dans des tubes de différents volumes génère des émulsions monodispersées capables de coder par codes-barres (figure du haut ci-dessous) :

• 3.500 cellules avec 35 µl d'hydrogel à codes-barres dans un tube de 500 µl.
• 225.000 cellules avec 2 ml d'hydrogel à codes-barres dans un tube de 15 ml.
• 1 million de cellules avec 10 ml d'hydrogel à codes-barres dans un tube de 50 ml.

La technique PIP-seq est également adaptable aux formats de plaques à 96, 384 et 1536 puits (figure du bas).

Source : Clark et al. (2023)

Exercice 8 - "Single-Cell trajectories"

a. Rappeler la notion de trajectoires. Expliquer la signification des bifurcations et des branches.

La grande diversité cellulaire résulte du caractère asynchrone de l'évolution des cellules et de l'ensemble des processus biologiques.

L'analyse bioinformatique de l'inférence des trajectoires permet de décrire la progression de chaque cellule individualisée de chaque type de cellules au cours des processus biologiques qui impliquent une évolution de ces cellules (différenciation, développement, processus pathologique, ...).

Les trajectoires mettent en évidence des points de ramifications où le devenir des cellules diverge : ces ramifications traduisent donc des décisions cruciales, à certains stades de ces processus, qui déterminent des destins cellulaires distincts.

b. Analyser la figure suivante.

Source : Dynverse & Cannoodt R. (2019)

Cette figure est la visualisation d'un modèle de trajectoires après réduction de dimensionnalité et regroupement de différents types de cellules.

Ces analyses bioinformatiques sont appliquées à un ensemble de cellules individualisées où les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) se différencient en neurones et myocytes.

Exercice 10

a. Analyser le paragraphe "2.2. Protein Enrichment Analysis" et la Figure 2 de l'article Chiaradia et al. (2019) "Proteome Alterations in Equine Osteochondrotic Chondrocytes" Int. J. Mol. Sci. 20, 6179

b. Partie "Materials and Methods" => paragraphe "4.4. Protein Enrichment Analysis" : quelles sont les 2 bases de données et les 2 applications ("plugins") de Cytoscape utilisés pour analyser les réseaux regroupés sur la base de la fonction des protéines dérégulées dans OC ?

Réponse :

• 2 bases de données STRING et Panther
• Les "plugins" CluePedia et ClueGO

ClueGO permet de visualiser les termes biologiques non redondants pour de grands groupes de gènes dans un réseau fonctionnellement regroupé.

• A partir des sources d'ontologies utilisées, les termes sont sélectionnés selon différents critères de filtrage.
• Les termes apparentés qui partagent des gènes associés similaires peuvent être fusionnés pour réduire la redondance.

CluePedia permet de rechercher de nouveaux marqueurs potentiellement associés à des voies ("pathways").

• CluePedia calcule les dépendances statistiques linéaires et non linéaires à partir de données expérimentales.
• Les gènes, les protéines et les miARN liés sur la base d'informations in silico et/ou expérimentales sont intégrés dans un réseau avec les termes/voies ClueGO.

c. Quelles informations ontologiques et quelles ressources ont permis d'enrichir les réseaux ?

Réponse : les processus biologiques, les fonctions moléculaires, le composant cellulaire, la base de données Reactome, les annotations de KEGG et de WikiPathways.

d. Quels sont les groupes fonctionnels les plus importants ?

Réponse : la glycolyse et la gluconéogenèse, le développement de la plaque de croissance et du cartilage, la régulation positive de l'import de protéines, l'activité du médiateur de l'adhésion cellule-cellule et le nucléoïde mitochondrial.