Enonce corrige exercices enzymologie Licence Enseignement et recherche Biochimie Emmanuel Jaspard Universite Angers biochimej

Exercices d'enzymologie

Exercice N°1 : inhibition compétitive

La cétostéroïde-isomérase catalyse l'isomérisation de différents Δ⁵-3-cétostéroïdes pour former des Δ⁴-3-cétostéroïdes conjugués tels que la Δ⁴-androstene-3,17-dione ou la testostérone.

Testosterone androstenedione nortestosterone Enzymology kinetics parameter inhibition non competitive incompetitive kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme deux substrat exces enzymologie Michaelis Menten Henri Lineweaver Burk radioactivite radioactivity biochimej

On étudie donc la réaction catalysée par cette enzyme (E) sur la Δ⁵-androstene-3,17-dione, en absence et en présence d'un inhibiteur (I), la 19-nortestostérone

On suit la réaction enzymatique en mesurant l'absorbance à λ = 248 nm et on obtient les résultats présentés dans le tableau ci-dessous.

[S]₀ (mM)	v_i (U.A.min^-1) / [I] = 0	v_i (U.A.min^-1) / [I] = 5.5 µM
0.083	0.08	0.051
0.122	0.11	0.072
0.195	0.15	0.106
0.238	0.17	0.122
0.340	0.20	0.150
0.580	0.26	0.200
0.870	0.29	0.240
1.170	0.30	0.270

1. Est-on en condition de substrat saturant ?
2. Déterminez V_max, K_M et k_cat (en s^-1) par la représentation des double inverses.
3. Déterminez les paramètres cinétiques V_max^app et K_M^app en présence de l'inhibiteur. Calculez la constante K_I. De quel type d'inhibition s'agit-il ?
4. Que suit-on à λ = 248 nm ?

Données : [E]₀ = 7.3 pM ; ε_M^produit = 17000 M^-1.cm^-1; U.A. = unité d'absorbance

Réponse

[S]₀ étudiée la plus faible = 8,3 10^-5M et [E]₀= 7,3 10^-12M, donc [S]₀ >> [E]₀ : on est en conditions de substrat saturant.

Expression de de V_Max

On passe de ΔA.min^-1 à µM.min^-1 avec la relation de Beer-Lambert :

Vmax (ΔA.min^-1)
V_Max (µM.min^-1) = -------------------
ε_M . l

V_Max = 23,5 µM.min^-1

Enzymology kinetics parameter inhibition non competitive incompetitive kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme deux substrat exces enzymologie Michaelis Menten Henri Lineweaver Burk radioactivite radioactivity biochimej

V_Max = V_Max^appet K_M ≠ K_M^app, donc l'inhibiteur est compétitif.

k_cat = V_Max / [E]₀= 3,2 10⁶min^-1 = 5,4 10⁴s^-1

K_I = (K_M x [I]) / (K_M^app - K_M) = 6,7 µM

A λ = 248 nm : la fonction carbonyle conjuguée du produit (Δ⁴-androstene-3,17-dione) absorbe alors que le substrat (Δ⁵-androstene-3,17-dione) n'absorbe pas.

Exercice N°2 : inhibition par excès de substrat

La lactate déshydrogénase catalyse la réduction réversible du pyruvate en lactate : pyruvate + NADH + H⁺ <=> lactate + NAD⁺

Les vitesses initiales de la réaction sont déterminées pour différentes concentrations [S]₀ de pyruvate.
La concentration du NADH est constante et égale à 5,4 10^-4M et K_M^NADH = 5,4 10^-5M.

On suit la disparition du NADH à λ = 340 nm en fonction du temps.

[S]₀ (mM)	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,8	1	2	3	4	5	9
v_i (U.A.min^-1)	0,075	0,125	0,157	0,180	0,200	0,212	0,232	0,250	0,270	0,270	0,250	0,240	0,190

1. Tracez la courbe de saturation et commentez l'allure.
2. Déterminez V_max et K_M par la représentation des double inverses.

Données : ε_M^NADH = 6000 M^-1.cm^-1; U.A. = unité d'absorbance

Réponse

courbe saturation Enzymology kinetics parameter inhibition non competitive incompetitive kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme deux substrat exces enzymologie Michaelis Menten Henri Lineweaver Burk radioactivite radioactivity biochimej

La forme de la courbe de saturation est caractéristique d'une inhibition par excès de substrat : l'incurvation de la courbe de saturation a lieu pour [pyruvate]₀ = 4 mM >> [NADH]₀ = 0,54 mM.

Il y a compétition entre les 2 substrats et formation du complexe [pyruvate - E - pyruvate] au lieu de [pyruvate - E - NADH].

courbe saturation exces substrat

V_Max = 0,34 UA.min^-1 => V_Max = 55 µmoles NADH oxydées.min^-1

K_M^pyruvate = 0,36 mM

Exercice N°3

Le séquençage de l'ADN par la méthode de Frederic Sanger repose sur le marquage radioactif des brins synthétisés. Quatre réactions sont effectuées simultanément, chaque milieu réactionnel contenant un nucléotide triphosphate radioactif (en général, la cytosine marquée au ³⁵S) en plus des quatre nucléotides triphosphate froids.

L'enzyme utilisée a longtemps été le fragment Klenow de la DNA polymérase I.
De manière schématique, la réaction d'incorporation de la 1ère cytosine peut s'écrire de la façon suivante: ADN(n) + dCTP³⁵S -> ADN(n+1)³⁵S + PP_i

Afin de déterminer les paramètres cinétiques de cette enzyme, on effectue 6 réactions de la manière suivante:

réaction	1	2	3	4	5	6
dCTP³⁵S (µL)	12,5	25	50	75	100	200

le volume réactionnel pour chaque réaction est de 10 mL;
la réaction est déclenchée par addition de 100 µL d'enzyme;
la concentration d'enzyme dans le milieu réactionnel est 1 µM;
le temps de réaction est 10 minutes;
la solution mère de dCTP³⁵S est à 10⁸ dpm.ml^-1 (dpm = désintégration par min) avec une activité spécifique de 500 µCi.mmole^-1 (1 Ci = 2 10¹² dpm).

Une fois la réaction arrétée, on prélève 1 mL de milieu réactionnel que l'on injecte sur une colonne de chromatographie (HPLC). On sépare le substrat radioactif restant et l'ADN radioactif formé l'un de l'autre et on mesure la radioactivité correspondant au pic du produit. Les résultats sont les suivants:

réaction	1	2	3	4	5	6
dpm	1250	2500	4000	5000	5500	6500

1. Déterminez les paramètres cinétiques de l'enzyme.

2. Calculez la valeur de la constante catalytique.

Exercice N°4

On étudie une réaction enzymatique (A -> B) catalysée par une enzyme E, en suivant la cinétique d'apparition de B :

[A]₀	Temps (min)
	1	2	3	4	5	6
	Variation d'absorbance (unités arbitraires)
[A]₀ = 1 mM	1	2	3	4	5	6
[A]₀ = 2 mM	2	4	6	7,5	9	10
[A]₀ = 5 mM	4	8	12	15	17,5	19,5
[A]₀ = 10 mM	5	10	15	19	22	24
[A]₀ = 20 mM	6	12	18	23	27	30

1. Tracez les cinétiques.

2. Déterminez les paramètres cinétiques de l'enzyme par la méthode graphique de votre choix.

Exercice N°5

Partie A : On étudie la fixation d'un inhibiteur de protéase I sur l'élastase E. La masse molaire de l'enzyme est de 25 kDa. Celle du complexe enzyme - inhibiteur est de 75 kDa.

On fait agir différentes concentrations d'inhibiteur marqué au ³²P pour une concentration fixe de l'enzyme : [E]₀ = 100 µM.
L'inhibiteur non fixé et le complexe enzyme - inhibiteur sont séparés par chromatographie (gel de filtration).
Pour chaque concentration initiale d'inhibiteur, on obtient deux pics de radioactivité : le pic 1 correspond à la (ou aux) molécule(s) éluée(s) en premier et le pic 2 correspond à la (ou aux) molécule(s) éluée(s) en second. L'enzyme libre est exclue du gel.

Le tableau suivant donne les valeurs de concentration des molécules de chaque pic :

Concentration molécule(s) Pic 1 (µM)	Concentration molécule(s) Pic 2 (µM)
10	5,60
20	12,3
40	34,0
55	60,0
70	117
90	437

1. A quelle(s) molécule(s) correspondent les pics 1 et 2 ?

2. Déterminez le nombre de site de fixation de l'inhibiteur et la constante de dissociation K_D.

Exercice N°5

Partie B : On suit la réaction enzymatique, en absence et en présence de l'inhibiteur I, en mesurant l'absorbance du produit. Pour différentes concentrations initiales en substrat, on obtient les vitesses initiales suivantes (U.A. : Unité Absorbance):

[S]₀ (mM)	v_i (U.A.min^-1) - sans inhibiteur	v_i (U.A.min^-1) - [I] = 9 mM
0,032	0,18	0,070
0,048	0,25	0.097
0,076	0,35	0,137
0,096	0,42	0,164
0,136	0,50	0,195
0,232	0,68	0,270
0,348	0,78	0,312

1. Déterminez les paramètres cinétiques (V_max, K_M et k_cat) et les paramètres cinétiques en présence de l'inhibiteur. Pour V_max la concentration doit être exprimée en molarité. Exprimez k_cat en sec^-1.

2. Précisez le type d'inhibition et calculez la constante d'inhibition K_I.

Données : l = 1 cm ; ε_M^produit = 2600 M^-1.cm^-1 ; [E]0 = 27 nM

Voir un cours sur la radioactivité.

Voir un cours sur la chromatographie.