L'adrénocorticotropine (ou corticotropine, "Adreno CorticoTropic Hormone", ACTH) est une hormone antéhypophysaire régulant la production de cortisol par les glandes surrénales.

L'ACTH est un peptide composé de 39 acides aminés dont la séquence est : SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF

1. On traite l'ACTH par la trypsine : combien de peptides obtient-on ? Quel est l'ordre de migration dans un gradient de pH ?

2. L'ACTH est marquée par l'iode radioactif (NaI¹²⁵) en présence de lactoperoxydase et de H₂O₂. On dépose le mélange sur un gel Séphadex G25 dont le domaine d'exclusion est de 5000. L'immunoréactivité de chaque fraction est mesurée avec des anticorps anti-ACTH. Le profil d'élution est présenté dans la figure ci-dessous.

• Expliquer l'expérience.
• Que représentent les pics A et B ?

3. Le produit A est traité par la trypsine puis analysé par chromatographie liquide à haute performance sur une phase réverse en C18. Les peptides sont élués par un gradient [propanol : eau] (figure ci-dessous).

Après séparation, les peptides radioactifs C et D sont analysés par isofocalisation, avant ou après traitement par la carboxypeptidase B, sur un gel de polyacrylamide avec un gradient de pH de 2 à 8, suivie d'une autoradiographie. Les résultats sont présentés dans la figure ci-dessous.

• Pistes 1 : peptide trypsique isolé C ou D
• Pistes 2 : peptide trypsique isolé C ou D après traitement par la carboxypeptidase B

a. Quel peptide est déposé sur le gel de gauche et sur le gel de droite, respectivement ?

b. Rappeler le mode d'action de la carboxypeptidase B.

Voir la pro-opiomélanocortine : molécule protéique précurseur de l'ACTH et d'une dizaine d'autres hormones polypeptidiques telles que la met-enképhaline, la β-endorphine, la β-lipotropine, ...

1. La trypsine (EC 3.4.21.4) coupe la liaison peptidique après Arg et Lys sauf si ces acides aminés sont suivis par Pro. Cependant elle peut avoir une spécificité plus complexe.

Le traitement de l'ACTH par la trypsine donne donc 4 peptides (1 à 4) et 2 acides aminés (Lys16 et Arg17).

Ordre de migration dans un gradient de pH

Calcul du pI du peptide 1 : NH₃⁺-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-COO^-

Calcul du pI du peptide 1 avec la formule la plus simple autour du zwitterion : pI = 1/2 [pK_a His + pK_a αNH₃⁺] ≈ 7,6

Applications de calcul de pI en ligne :

• "Compute pI/MW" - Expasy
• "Protein isoelectric point calculator"
• "Protpi - Protein tool"
• "Peptide property calculator"

Les valeurs sont parfois assez différentes d'un prédicteur à l'autre.

Voir un développement sur les gels bidimensionnels : gel d'isoélectrofocalisation (IEF) et gel d'électrophorèse de polyacrylamide en conditions dénaturantes.

2. Le contenu des fractions d'élution du pic A est radioactif et immunoréactif.

Par ailleurs la masse molaire de l'ACTH = 4541 Daltons, valeur qui est de l'ordre de la limite d'exclusion du gel Séphadex G25.

Donc :

• pic A => ACTH marquée
• pic B => NaI¹²⁵ en excès (masse molaire NaI = 150)

En présence de peroxydase, d'H₂O₂ et de tyrosine, les ions iodure sont transformés en iode positif (I⁺) qui substituent les hydrogènes en position ortho du noyau aromatique de la tyrosine (figure ci-dessous).

• La réaction peut aussi avoir lieu sur l'histidine.
• La lactoperoxydase (EC 1.11.1.7) est présente dans la salive, dans les larmes et dans le lait.

En conséquence, les peptides issus de la digestion trypsique et qui contiennent une ou plusieurs Tyr sont radioactifs.

Il s'agit de :

• peptide 1 : NH₃⁺-Ser-Tyr^*-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-COO^-
• peptide 4 : NH₃⁺-Val-Tyr^*-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Gln-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-COO^-

3. Par chromatographie en phase réverse, les peptides hydrophiles sont élués avant les peptides hydrophobes.

Les carboxypeptidases (EC 3.4.17.2) font partie d'une trés grande famille d'hydrolases (peptidase M14). Elles hydrolysent les peptides intermédiaires qui résultent de la dégradation des protéines par les protéases digestives (pepsine, trypsine, chymotrypsine).

Elles sont sécrétées dans le suc pancréatique sous la forme de précurseurs inactifs appelés (zymogènes) : les pro-carboxypeptidases. Elles sont activées dans l'intestin par hydrolyse partielle par la trypsine.

La carboxypeptidase B hydrolyse préférentiellement les peptides qui ont un acide aminé à caractère basique (Arg, Lys) en position C-terminale.

Mais elle catalyse aussi d'autres réactions d'hydrolyse non spécifiques et des réactions de trans-estérification.

En revanche, le pI du peptide 4 n'est pas modifié puisque la carboxypeptidase B ne l'hydrolyse pas (ou alors c'est Phe qui est éliminé).

• Isofocalisation : migration jusqu'à une valeur de pH = pI du peptide.
• Autoradiographie : révélation des bandes électrophorétiques par impression d'un film photographique par la radioactivité portée par la iodotyrosine.

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