Position des ponts disulfures dans un peptide
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Un polypeptide donne après réduction deux peptides dont les séquences sont :

  • Peptide 1 : Ala-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg-Arg-Val-Cys
  • Peptide 2 : Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys

Le polypeptide natif (ponts disulfures non réduits) est hydrolysé par la thermolysine. 4 sous-polypeptides (A, B, C et D) sont obtenus dont la composition est :

  • Peptide A : (Ala / 2 Cys / Val)
  • Peptide B : (Arg / Lys / Phe / Prol)
  • Peptide C : (2 Arg / 2 Cys / Trp / Tyr)
  • Peptide D : (2 Cys / Phe)

Déterminer la séquence du polypeptide et la position des ponts disulfures.

 

1. Réponse

La thermolysine (EC 3.4.24.27) est une métalloprotéase (famille des peptidases M4) thermostable produite par un grand nombre de bactéries dont la bactérie gram-positive Bacillus thermoproteolyticus.

Elle a besoin d'un ion zinc pour son activité enzymatique et 4 ions calcium pour la stabilité de sa forme active.

Elle catalyse l'hydrolyse spécifique de la liaison peptidique impliquant des acides aminés hydrophobes : Leu / Ile / Phe / Trp / Tyr et Val. La coupure se fait avant ces acides aminés.

Il est à noter qu'elle est utilisée aussi pour son aptitude à catalyser la réaction réverse : la formation de la liaison peptidique.

Nombre de ponts

Dans cet exercice, le peptide contient 6 cystéines, donc 3 ponts disulfures au maximum (figure ci-dessous).

  • la première cystéine peut être appariée avec n'importe laquelle des 5 autres cystéines pour former le premier pont
  • il reste 4 cystéines qui peuvent s'apparier de 3 manières différentes
  • il reste 2 cystéines qui s'apparient

    Soit : 5 x 3 x 1 = 15 combinaisons

 

De manière générale :

  • pour n ponts disulfures
  • 2n cystéines

il existe [(2n)! / 2nn!] combinaisons.

L'obtention de 2 chaînes polypeptidique (peptide 1 et peptide 2) après réduction indique 1 pont disulfure inter-chaînes.

La composition en acides aminés des peptides A à D indique 2 ponts disulfures intra-chaîne.

Pont disulfure peptide disulfide bridge cysteine peptide biochimej

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2. La cystéine

La cystéine est génétiquement codée par les 2 codons : UGU et UGC.

La chaîne latérale de la cystéine (acide L-2-amino-3-mercaptopropionique) porte un groupement sulfhydryle (-SH) extrêmement réactif. Son pKa est de 8.33.

L'autre acide aminé sulfuré, la méthionine, porte un groupe méthyle supplémentaire. La méthionine est plus hydrophobe, d'un encombrement stérique plus important et moins réactive.

cysteine methionine pont disulfure peptide disulfide bridge biochimej

3. Formation d'un pont disulfure

a. Introduction

Un pont disulfure est une liaison covalente entre 2 atomes de soufre de la chaîne latérale de 2 résidus cystéines (Cys) réduits.

Les ponts disulfure sont formés dans un environnement cellulaire oxydant. Le cytoplasme n'étant pas un milieu oxydant, il y a trés peu de protéines intracellulaires qui possèdent des ponts disulfure.

Toutes les cystéines d'une protéine ne forment pas un pont disulfure :

  • en fait, si l'on examine le fichier PDB-select 25, on s'aperçoit que seulement 27% des protéines contiennent des ponts disulfure.
  • par ailleurs, on ne connait pas les règles qui régissent la sélection de telle ou telle cystéine d'une protéine pour établir un pont disulfure.

Un pont disulfure peut être établi entre 2 cystéines :

  • d'une même chaîne polypeptidique : on parle de pont inTRA - chaîne
  • appartenant à 2 chaînes polypeptidiques (identiques ou différentes) : on parle de pont inTER - chaîne

Le nombre de ponts disulfure (intra et/ou inter) au sein des protéines varie trés grandement : les toxines, bien qu'étant de petites protéines (20 à 30 acides aminés) peuvent en contenir jusqu'à 5, voire 6.

L'énergie libre de liaison qui résulte de la formation d'un pont disulfure est d'environ - 3,5 kcal/mol. C'est une énergie importante qui contribue de manière significative à la stabilisation de la structure tridimentionnelle native de la protéine.

Cependant, les ponts disulfure ne jouent pas un rôle déterminant dans le repliement des protéines, puisque les intermédiaires adoptent des conformations transitoires qui peuvent être éloignées de celles qui mettent en jeu ces ponts disulfure.

La distance entre les 2 carbones α de 2 résidus cystéine impliqués dans un pont disulfure est de 4.2 Å à 7.5 Å.

L'entité structurale formé par 2 cystéines reliées par un pont disulfure s'appelle une cystine.

La formation d'un pont disulfure est une réaction d'oxydo-réduction réversible : cette réversibilité dépend du potentiel rédox du milieu et du pH.

Pont disulfure peptide disulfide bridge cysteine peptide biochimej

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b. La réaction de formation d'un pont disulfure

Au cours de la réaction d'échange [thiol - disulfure], un anion thiolate R1S- déplace un soufre du pont disulfure R2-S-S-R3.

reaction echange thiol disulfure anion thiolate pont disulfure peptide disulfide bridge cysteine biochimej

Dans l'état de transition, la charge négative du thiolate est délocalisée sur les 3 atomes de soufre.

Les ponts disulfure sont formés et réduits au sein des protéines par 2 réactions d'échange [thiol - disulfure] avec un agent oxydo-réducteur tel que :

  • le dithiothréitol (DTT oxydé / DTT réduit)
  • le glutathion (GSSG / GSH). Il joue par ailleurs des rôles capitaux dans la détoxification de la cellule.

Pont disulfure peptide disulfide bridge cysteine reduction dithiothreitol biochimej

reduction glutathion pont disulfure peptide disulfide bridge cysteine biochimej

La réaction d'échange [thiol - disulfure] peut aussi avoir lieu au sein d'une même protéine : un groupe thiolate d'une protéine peut attaquer un pont disulfure de la même protéine, conduisant à un remaniement des ponts disulfure.

reaction echange thiol disulfure pont disulfure peptide disulfide bridge cysteine peptide biochimej

 

Liens Internet et références bibliographiques
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