1. Enoncé

2. Réponse partie A

3. Réponse partie B

4. Réponse partie C

5. Complément d'information sur la sapécine

6. Références bibliographiques

1. Enoncé

Certains diptères synthètisent des polypeptides qui possèdent une fonction double. L'un de ces polypeptides, la sapécine, synthètisé par la mouche Sarcophaga peregrina, est un facteur de croissance des cellules embryonnaires de la mouche et également un antibactérien.

Sur la base de ses propriétés antibactériennes, c'est-à-dire sa capacité à inhiber la croissance d'une culture bactérienne, la sapécine est purifiée à partir de cellules embryonnaires en culture.

Partie A : à partir de 900 mL de milieu de culture, les étapes de purification donnent les résultats présentés dans le tableau ci-dessous.

a. Rappelez le principe des techniques utilisées à chaque étape. Comment l'activité totale est-elle mesurée ?
b. Calculez le rendement et le facteur de purification à chaque étape.
c. Le polypeptide obtenu à la dernière étape peut-il être considéré comme "pur" ? Justifiez la réponse.

Partie B : une quantité inconnue du polypeptide purifié est prélevée dans le but d'en déterminer la composition en acides aminés.

a. Rappeler le principe de la technique.
b. Déterminer la composition en acides aminés minimale à partir des résultats suivants : Leu 45 / Thr 7,5 / Cys 45 / Glu 30 / Ile 7,5 / Asx 7,5 / Arg 30 / Ser 15 / His 7,5 / Lys 15 / Gly 7,5 / Tyr 15 / Ala 7,5 / Val 15

Partie C : afin de déterminer la présence éventuelle de ponts disulfures, on fait réagir le polypeptide avec un mélange d'iodoacétamide et d'acide iodoacétique (iodoacétate), tous deux marqués au carbone 14.
Les composés qui se sont fixés sont ensuite visualisés par autoradiographie après séparation sur gel de polyacrylamide en conditions natives.
Dans ce but, des quantités arbitraires équivalentes du polypeptide purifié natif (figure A ci-dessous) ou préalablement réduit par le dithiothréitol (figure B ci-dessous) sont traitées de la manière suivante :

Le polypeptide natif et non traité par les réactifs radioactifs migre sous la forme d'une bande au même niveau que l'échantillon de la piste 1 du gel A ou du gel B (figure ci-dessus).

a. Expliquer l'apparition des bandes radioactives observées sur l'autoradiogramme.
b. Quel est le nombre de cystéines libres et/ou impliquées dans un pont disulfure ?
c. En faisant une recherche bibliographique, déterminer :

• si la sapécine est synthétisée sous forme d'un précurseur
• la composition en acides aminés de la sapécine
• le nombre réel de ponts disulfure
• la masse molaire de la sapécine

Les différents types d'échangeurs d'ions

Les échangeurs d'ions sont des billes qui portent des groupements ionisables dont la charge est :

Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé :

• Dans le cas d'une base (échangeur d'anions), le pH doit être inférieur au pK_a du groupement ionisable (exemple : le pK_a du groupement diéthylaminoéthylammonium est 9,5).
• Dans le cas d'un acide (échangeur de cations), le pH doit être supérieur au pK_a du groupement ionisable (exemple : le pK_a du groupement carboxyméthyl est 4).

Les molécules à séparer sont dans le même tampon (donc au même pH) et en fonction de leur point isoélectrique (pI), elle porte une charge nette :

• négative : le pI de l'albumine de sérum bovin est 4,9, cette protéine est chargée négativement à pH 7
• nulle
• positive : le pI du cytochrome c est 10,7, cette protéine est chargée positivement à pH 7

Il y a deux manières d'éluer les molécules fixées sur la résine :

• En modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que l'échangeur d'ions) ; il n'y a plus alors d'interaction électrostatique entre les molécules et le groupement chargé porté par la résine et les molécules sont éluées.
• En ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion de même charge que les molécules fixées à la résine : cet ion s'appelle un contre - ion.

• cations monovalents : Li⁺ < H⁺ < Na⁺ < NH₄⁺
• cations divalents : Cd₂⁺ < Mn₂⁺ < Mg₂⁺ < Zn₂⁺ < Cu₂⁺ < Ca₂⁺ 
• de plus, l'efficacité augmente avec la charge : K⁺ < Ca₂⁺ < Al₃⁺ 

Chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel

Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première approximation sur la masse molaire des molécules à séparer.

En toute rigueur, le paramètre physico-chimique qui intervient est la dimension des molécules, donc leur volume et donc plus précisément leur rayon de Stokes. Mais cette relation univoque [masse molaire - rayon de Stokes] n'est valable que pour des protéines dites "globulaires", c'est-à-dire assimilées à des sphères.

Différents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent fausser la détermination de la masse molaire réelle par ce type de chromatographie :

• La géométrie : pour une même masse molaire, une protéine "allongée" (exemple, la calmoduline) n'aura pas les mêmes dimensions qu'une protéine globulaire.
• Les modifications post-traductionnelles : par exemple, les longues chaînes d'oses modifient fortement la géomètrie des protéines glycosylées et les rend plus denses ; à l'inverse, les lipoprotéines sont "allégées" par la présence de lipides.
• La présence de sels, d'agents chaotropiques, de détergents ... 

La phase stationnaire est constituée de billes de polysaccharides (type "Sephadex") gonflées dans le solvant utilisé pour l'élution :

• Le volume des billes est très finement calibré.
• Ainsi les molécules dont le volume est supérieur à celui des billes ne peuvent y pénétrer et sont éluées rapidement.
• En revanche, les molécules dont le volume est inférieur à celui des billes y pénétrent et y subissent des frottements qui les retardent.

Chromatographie à polarité de phase inversée ou en phase reverse

Les matrices pour chromatographie en phase reverse sont souvent à base de silice (SiO₂), appelée aussi gel de silice car elle est plus ou moins hyratée. La silice provient de la déshydratation de l'acide silicique et se présente sous forme d'une poudre dont les grains (les billes) sont très fins.

• Ces billes peuvent être sphériques ou irrégulières.
• A la surface de la silice on trouve des groupes silanols (-OH) et des groupes siloxanes (-O-) qui lui confèrent un caractère polaire et acide et qui lui permettent de former des liaisons hydrogènes.

On utilise fréquemment une silice sur laquelle des chaînes alkylées (voir les différents groupes dans le tableau ci-dessous) sont greffées au niveau des groupements silanols.

Les chaînes alkylées confèrent à la silice un caractère très hydrophobe :

• Si la phase mobile est très polaire (donc très peu hydrophobe), certaines molécules hydrophobes vont établir des interactions hydrophobes avec la phase stationnaire et ainsi être adsorbées
• On augmente alors la concentration en solvant organique (apolaire donc hydrophobe) dans la phase mobile
• A une concentration donnée l'hydrophobicité de la phase mobile étant plus importante que celle de la phase stationnaire, les molécules hydrophobes sont désorbées et éluées.

La phase mobile

Elle est donc constituée d'un mélange eau / solvant organique, en proportion variable.

La phase aqueuse : l'eau est le solvant le plus polaire (le moins hydrophobe). On ajoute un sel pour tamponner le milieu. Cependant, on emploie souvent un acide fort (l'acide trifluoroacétique) et une amine quaternaire (la triéthylamine, par exemple) car ces deux composés ioniques forment des paires d'ions avec les molécules à séparer, neutralisant ainsi des charges portées par ces dernières. Celà a pour conséquence d'augmenter l'hydrophobicité des molécules et ainsi qu'elles s'adsorbent davantage sur la phase stationnaire.

Le solvant organique :

• Il en existe un grand nombre que l'on peut utiliser puisque la silice leur résiste. Cependant, les plus employés sont l'acétonitrile et le méthanol.
• Le choix du solvant organique dépend grandement de l'hydrophobicité des molécules à séparer : pour des molécules très hydrophobes, on peut choisir d'utiliser une forte concentration d'un solvant organique de polarité moyenne ou une faible concentration d'un solvant organique de polarité faible.
• Les solvants organiques ne doivent pas comporter d'impurétés ni avoir une forte absorbance aux faibles longueurs d'onde (ultra-violet) pour ne pas interférer avec les propriétés optiques des molécules à séparer. De plus selon sa qualité, on peut ou non utiliser un solvant organique pour un type d'analyse donnée. En conséquence, il faut prendre des solvants certifiés "ultra-purs" qui coûtent chers. 

Voir un cours sur les différentes techniques de chromatographie.

La concentration des protéines

L'ultrafiltration : l'échantillon est mis dans un tube. Ce tube contient une membrane semi-perméable dont les pores ont un diamètre tel que seules l'eau et des molécules au-dessous d'une certaine masse molaire choisie ("cut-off") peuvent la franchir. Le tube est placé dans une centrifugeuse et, sous l'action de la force centrifuge, l'eau et les petites molécules traversent la membrane.

Une autre méthode de concentration est la précipitation par un sel (exemple : le sulfate d'ammonium). La précipitation par un sel nécessite de dialyser l'échantillon après concentration.

Ces techniques de concentration occasionnent souvent des pertes importantes de matériel.

Source : Millipore

2. Réponse partie A

L'activité totale (AT) correspond à l'activité antibactérienne de la sapécine : 1 unité d'activité antibactérienne est la quantité de polypeptide qui entraine 50% d'inhibition de la croissance bactérienne (Escherichia coli) par rapport à un contrôle.

Le polypeptide peut être considéré comme "pur" car une forte activité totale (AT) est conservée pour une quantité minime de protéines en regard des valeurs initiales.

Bien évidemment, à l'échelle moléculaire et compte-tenu du nombre d'Avogadro, aucun corps (hormis sous forme de cristal "pur") ne peut être considéré comme totalement pur. A fortiori en ce qui concerne les protéines extraites de milieux extrêmement composites et complexes comme la cellule.

Cependant, l'enrichissement est tel (facteur de purification de 1453) que, macroscopiquement, on peut considérer que la solution ne contient "quasi exclusivement" que le polypetide purifié.

3. Réponse partie B

Conditions d'hydrolyse totale acide des liaisons peptidiques pour la détermination de la composition minimale en acides aminés : réduction des ponts disulfure / HCl 6N / 110°C pendant 24 à 72 h.

• L'hydrolyse est ralentie par les acides aminés dont la chaîne latérale est encombrante.
• Les fonctions amides sont transformées en fonction acide : Asn et Gln sont donc oxydés en Asp et Glu (Asx = Asp + Asn / Glx = Gln + Glu).
• Le Trp est détruit sauf si le polypeptide est au préalable protégé par des groupements thiol ou phénol. La Tyr résiste davantage à l'hydrolyse.

Les acides aminés sont ensuite :

• Soit séparés par chromatographie d'échange d'ion puis quantifiés après dérivation par la ninhydrine (2,2-dihydroxyindane-1,3-dione - figure ci-contre). L'absorbance des dérivés est mesurée à 570 nm. Remarque : la proline ne réagit pas avec la ninhydrine.

• Soit dérivés au préalable par le phénylisothiocyanate (appelé aussi réactif d'Edman / PITC) puis séparés et quantifiés par chromatographie en phase réverse.

La composition en acides aminés est rapide (15 minutes) et nécessite environ 1 pmole de chaque acide aminé. On obtient une estimation du pourcentage de chaque acide aminé dans la chaîne polypeptidique.

Remarque : cette technique est de moins en moins utilisée car il n'est pas nécessaire de déterminer la composition en acides aminés pour déterminer la séquence. En effet, de plus en plus de séquences peptidiques sont :

• Soit traduites in silico à partir des séquençes des génomes, avec les risques d'erreur que celà comporte.
• Soit déterminées par spectromètrie de masse en tandem (protéomique).

Les valeurs obtenues après hydrolyse acide sont multiples de 7,5 [Leu 45 / Thr 7,5 / Cys 45 / Glu 30 /Ile 7,5 / Asx 7,5 / Arg 30 / Ser 15 / His 7,5 / Lys 15 / Gly 7,5 / Tyr 15 / Ala 7,5 / Val 15].

• La quantité correspondant à une unité est donc 7,5.
• En divisant les valeurs par 7,5, on obtient la composition minimale : L6 / T1 / C6 / E4 / I1 / Asx1 / R4 / S2 / H1 / K2 / G1 / Y2 / A1 / V2
• Soit 34 acides aminés au minimum.

4. Réponse partie C

L'iodoacétamide et l'iodoacétate sont des réactifs des groupements thiols (-SH) :

• L'iodoacétamide ne change pas la charge.
• L'iodoacétate introduit une charge négative par -SH dérivé.

Il est donc capital de séparer les dérivés par électrophorèse en conditions natives afin que les différentes formes du polypeptide migrent seulement en fonction de leurs charges nettes respectives.

Plus le polypeptide est chargé négativement, moins il migre : c'est le traitement au iodoacétate radioactif 100% => piste 5 des gels A et B.

Le dithiothréitol (DTT - aussi appelé réactif de Wallace Cleland) réduit les ponts disulfures. Toutes les Cys sont accessibles aux réactifs.

Le dithioérythritol (épimère du DTT) est aussi un agent réducteur, mais moins efficace que le DTT.

Enfin, l'iodoacétamide et l'iodoacétate étant radioactifs, les Cys qui réagissent sont elles aussi marquées au ¹⁴C. Lors de l'autoradiographie, la radioactivité impressionne le film aux endroits où migrent les différentes formes du polypeptide.

Interprétation de la figure du gel natif A

• A 66% d'iodoacétamide, il existe des polypeptides totalement marqués par l'iodoacétate.
• Inversement, à 66% d'iodoacétate, il existe des polypeptides totalement marqués par l'iodoacétamide.

Mais on ne peut pas visualiser de bandes car ces polypeptides sont à l'état de trace*.

Conclusions

1. Le polypeptide natif et non traité par les réactifs radioactifs migre exactement comme la bande 1 du gel A ou du gel B : la sapécine est un monomère.

2. Une bande apparaît dans la piste 1 du gel B et sept bandes apparaissent dans la piste 6 du gel B : la sapécine contient 6 cystéines.

3. Deux bandes additionnelles apparaissent dans la piste 6 du gel B par rapport à la piste 6 du gel A. La réduction par le DTT révèle 2 Cys supplémentaires : il y a 1 pont disulfure.

Voir un cours sur les cystéines et la formation des ponts disulfure.

La sapécine mature contient 3 ponts disulfures (figure ci-contre) : Cys 3 - Cys 30 / Cys 16 - Cys 36 / Cys 20 - Cys 38 (numérotation par rapport à la forme mature - voir ci-dessous).

Sapécine de Sarcophaga peregrina - Hanzawa et al. (2002) - Code d'accès : MMDB : 19110 / PDB : 1L4V

L'énoncé présente donc des profils électrophorètiques qui ne reflètent pas la réalité, et ce, dans un but pédagogique afin de mieux comprendre la démarche pour déterminer le nombre de cystéines et de ponts disulfures dans une protéine.

Quels seraient les profils électrophorètiques avec 6 cystéines impliquées dans 3 ponts disulfures ?

Visualisation de la sapecine de Sarcophaga peregrina - RMN en solution.

Code PDB : 1L4V

La forme mature de la sapécine correspond donc aux acides aminés 55 à 94, soit 40 acides aminés et une masse molaire de 4080 Daltons.

Séquence de la sapécine mature : A₁TC₃DLLSGTGINHSAC₁₆AAHC₂₀LLRGNRGGYC₃₀NGKAVC₃₆VC₃₈RN₄₀

Source : Takeuch et al. (2004)

C'est une protéine basique avec une charge nette cationique de +3 au pH physiologique.

Des interactions électrostatiques s'établissent entre les acides aminés basiques et un phospholipide acide, la cardiolipine. Ces interactions entraînent la formation de pores puis la perméabilisation de la membrane des bactéries. Lors de cette interaction, la sapécine adopterait une structure oligomèrique.

Source : Takeuch et al. (2004)

Synthèse de cette correction au format PDF (tous droits réservés biochimej).