Définir la notion d'organites.

Le but du "Human Cell Atlas" (HCA) est de caractériser toutes les cellules de l'être humain.

Figure ci-dessous : aperçu de 13 protéomes d'organites majeurs et de 1 protéome de protéines sécrétées définis dans HCA en localisant les protéines de 30 structures subcellulaires d'une seule cellule ("single cell").

Source : Thul et al. (2017) "A subcellular map of the human proteome" Science 356, eaal3321

Figure ci-dessous :

• 30 structures subcellulaires annotées dans HCA et visualisées par microscopie à immunofluorescence (le côté de chaque image représente 64 µm).
• Ces données ont été validées par spectrométrie de masse.
• Cette localisation expérimentale est basée sur la distribution in situ de ≈ 12.000 protéines issues de 22 lignées cellulaires humaines et révélées par ≈ 14.000 anticorps.

Source : Thul et al. (2017) "A subcellular map of the human proteome" Science 356, eaal3321
En vert : protéines; en rouge : microtubules marqués avec un anticorps anti-tubuline; en bleu : noyau coloré par le DAPI.

Voir les base de données :

• OpenOrganelle : visualisation des cellules et des tissus à l'échelle du nanomètre.
• BioImage Model Zoo : modèles d'images générés par intelligence artificielle.

Voir un développement sur les organites.

Interpréter la figure 1 de l'article Poggio et al. (2022).

Les sites de contacts entre les membranes de 2 organites (ou sites de contact membranaires) sont des régions des membranes enrichies en protéines spécialisées qui maintiennent les 2 organites à proximité (de 10 nm à 80 - 100 nm) sans fusion des deux membranes impliquées.

Certains des sites de contacts membranaires connus sont résumés dans la figure ci-dessous.

Source : Poggio et al. (2022)
Etoile verte : contacts prouvés par une sonde fluorescente disponible et validée par la littérature.
Etoile bleue : contacts pour lesquels il n'existe pas encore d'outil fluorescent.

Rôles des sites de contacts membranaires

Trois types de fonctions ont été suggérés :

• Le transport bidirectionnel spécifique d'ions (notamment le calcium), de lipides, d'acides aminés et de métaux.
• La transmission d'informations de signalisation pour la régulation des activités de remodelage des organites : la biogenèse, le positionnement, la dynamique, la fission, l'héritage et l'autophagie des organites.
• Le positionnement, en trans, d'enzymes de manière à réguler leur activité. Exemples : Sac1 (phosphatidylinositol-phosphate phosphatase - E.C. 3.1.3.64) et PTP1B (protéine tyrosine phosphatase 1B - E.C. 3.1.3.48).

Du point de vue interactomique, la coordination des voies de signalisation au sein d'une cellule qui contient des organites correspond à un réseau dont :

• Les organites sont les nœuds.
• Les sites de contact entre les membranes des organites sont les bords.

Outils pour l'étude des sites de contact membranaires

Les sondes fluorescentes pilotées par la proximité détectent et quantifient les sites de contact membranaires entre organites et leur dynamique spatio-temporelle dans différentes conditions.

Interpréter la figure 3 de l'article Poggio et al. (2022).

Le schéma ci-dessous décrit la mise en évidence d'un site de contact membranaire entre 2 organites (organelles 1 et 2) par la technique du FRET ("Fluorescence Resonance Energy Transfer") avec une paire de protéines fluorescentes : CFP (donneur de FRET) et YFP (accepteur de FRET).

Chaque fluorophore est fusionné à une protéine spécifique de la membrane de chacun des organites étudiés ou à une séquence en acides aminés qui cible cet organite (rectangles magenta et bleu clair).

Source : Poggio et al. (2022)

(1) Sans interaction entre les 2 organites, la distance_CYP-YFP > 10 nm :

• Il n'y a pas de FRET [CFP -> YFP].
• Si CFP est excitée à 405 nm, le seul signal d'émission de fluorescence est celui de CFP elle-même (λ_émission = 480 nm).

(2) Interaction entre les 2 organites, la distance_CYP-YFP < 10 nm :

• Il y a un FRET [CFP -> YFP].
• Si CFP (donneur de FRET) est excitée à 405 nm, YFP (accepteur de FRET) est excitée : l'émission de fluorescence de YFP est détectée (λ_émission = 528 nm).

Figure ci-dessous : exemples de paires de protéines formant des sites de contacts [réticulum endoplasmique (RE) - mitochondrie] ("ER - Mitochondria Contact Sites" - ERMCS) chez les mammifères.

Source : Xu et al. (2020)
"Endoplasmic Reticulum–Mitochondria Contact Sites and Neurodegeneration" Front. Cell. Dev. Biol. 8, 428

• "Vesicle-Associated Membrane Protein (VAMP)-Associated Protein (VAP) B" - (VAPB) / "Protein Tyrosine Phosphatase-Interacting Protein 51" (PTPIP51)
• Mfn1 / Mfn2
• "Inositol 1,4,5-trisPhosphate Receptor" (IP3R) / complexe ["Glucose-Regulated Protein 75" (GPR75) - "Voltage-Dependent Anion Channel" (VDAC1)]
• "B-cell receptor-associated protein 31" (Bap31) / "Fission 1 homolog" (Fis1)

Expliquer les constructions génétiques pour synthétiser les protéines de fusion spécifique de la membrane de tel ou tel organite.

Le vecteur pLVX-mCherry est un vecteur d'expression lentiviral basé sur le virus VIH-1 : les particules lentivirales infectent les cellules cibles et permettent la transcription du gène d'intérêt fusionné à la protéine fluorescente mCherry.

Voir la construction du vecteur lentiviral de transcription de mCherry fusionné à la séquence polypeptidique N-terminale du cytochrome b5 pour cibler la face cytoplasmique (membrane externe) du réticulum endoplasmique.

• Marqueur de sélection de clones positifs : puromycine.
• Pepetide de liaison de 7 résidus d'acides aminés (SGLRSGK) entre mCherry et Cb5.