1. Généralités sur les récepteurs couplés aux protéines G

2. Les principales classes (ou familles) de récepteurs couplés aux protéines G

3. Classification et des RCPG via leur spécificité de fixation de ligand

4. Détails de la structure conservée des récepteurs couplés aux protéines G

5. Comparaison des conformations active et inactive d'un RCPG modèle

6. Comparaison des RCPG de la classe A et de la classe B

7. Liens Internet et références bibliographiques

1. Généralités sur les récepteurs couplés aux protéines G

On recense plus de 1000 récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) (voir un cours).

Les séquences codantes de leur gènes représentent plus de 1% du génome : plus de 800 gènes ont été identifiés chez l'homme (voir Fredriksson et al., 2003).

Quelques représentants des différentes classes de RCPG dont la structure a été déterminée :

• rhodopsine (bovine rhodopsin et squid rhodopsin)
• RCPG aminergiques : β-adrenoceptors (avian β1-AR / human β2-AR), muscarinic acetylcholine receptors (human M2R / rat M3R), human H1 histamine receptor2, human D3 dopamine receptor
• RCPG fixant les nucléosides : human adenosine A2A receptor (A2AR)
• RCPG fixant les peptides : human CXCR4 chemokine receptor, opioid receptors (human nociceptin receptor5 / κ-OR26 / mouse μ-OR27 / δ-OR28), rat neurotensin receptor (NTSR1), human protease-activated receptor (PAR1)
• RCPG fixant les lipides : GPCR : human sphingosine-1 phosphate (S1P1) receptor
• human CXCR1 chemokine receptor
• Base de données : "IUPHAR database"
• Base de données : "GPCRDB"

Source : Katritch et al. (2013)

Figure ci-dessous : évolution du nombre et de la qualité des structures de GPCR déterminées par différentes techniques.

Source : Venkatakrishnan et al. (2013)

La structure globale de la grande majorité des RCPG est caractérisée par :

Source : "Récepteurs couplés aux protéines G"

• L'extrémité N-terminale extracellulaire qui peut subir des modifications post-traductionnelles de type N-glycosylation.
• 7 hélices α trans-membranaires (TM1 à TM7) reliés par 3 boucles intracellulaires (I1, I2, I3) et 3 boucles extracellulaires (El, E2, E3).
• Un (ou plusieurs) pont disulfure entre les boucles El et E2.
• L'extrémité C-terminale intracellulaire qui possède parfois des sites d'ancrage lipidique dans la membrane (création d'une 4ème boucle, I4) : ces sites d'ancrage résultent d'une modification réversible de cystéines par palmitoylation. Le palmitate interagit avec une molécule de cholestérol (C) (Zheng et al., 2012).
• L'extrémité C-terminale intracellulaire qui peut-être phosphorylée (PP) sur différents résidus par la protéine kinase A, la protéine kinase C ou les GRK ("G-protein-coupled receptor kinases").

2. Les principales classes (ou familles) de récepteurs couplés aux protéines G

Conformément aux directives de l'"International Union of Basic and Clinical Pharmacology", les RCPG non-sensoriels (c'est-à-dire à l'exclusion donc des récepteurs de lumière, odeur et goût) peuvent être classés, selon leurs propriétés pharmacologiques, en quatre grandes familles ou classes (selon les nomenclatures) :

• la classe A de type rhodopsine (Rho, PDB 2HPY)
• la classe A de type non rhodopsine, subdivisée en récepteurs aminergiques (β2AR, PDB 3P0G), récepteurs nucléotidiques (A2AAR, PDB 3QAK), récepteurs "peptide-like" (μ-OR, PDB 5C1M) et récepteurs de type lipide (CB1R, PDB 5XRA)
• la classe B1 de type sécrétine
• la classe B2 de type molécules d'adhérence
• la classe C de type métabotrope (calcium, GABA, glutamate, phéromone)
• la classe F qui inclut les récepteurs "frizzled"
• la classe Taste 2 (T)

Les GPCR chez l'homme sont activés à partir de différents sites de liaison de ligands endogènes dans le domaine transmembranaire (classe A) ou dans le domaine extracellulaire (classe C) ou dans les deux (classes B et F). Les classes ont une très faible similarité de séquence : une moyenne de 23 % pour les paires de classes croisées.

Source : S. Martin

Source : P. Sarret

3. Classification des RCPG via leur spécificité de fixation de ligand

Il existe de nombreux exemples de protéines ayant des similitudes structurales qui fixent des ligands différents et qui ont donc des fonctions différentes. A l'inverse, il existe de nombreux exemples de protéines ayant des similitudes fonctionnelles avec des structures différentes.

Le nombre croissant de RCPG de différentes classes identifiés et de leur(s) ligand(s) permet, non pas de comparer les séquences protéiques, mais l'ensemble des ligands connus pour se fixer à un type de RCPG. La classification des protéines via leur similitude de liaison à un ou des ligand(s) est une approche alternative aux méthodes évolutives pour mieux comprendre la fonction des protéines et la transduction des signaux.

La comparaison du dendrogramme basé sur la similarité des ligands à celui basé sur la similarité des séquences de RCPG de la classe A (figure de gauche ci-dessous), a permis d'identifier des RCPG éloignés du point de vue de leurs séquences mais qui ont des similitudes de spécificité de ligand.

Ce genre d'approche a des applications dans la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques et la mise au point de nouveaux médicaments.

Source : Lin et al. (2013) et GPCR network

4. Détails de la structure conservée des récepteurs couplés aux protéines G

La structure d'un RCPG peut être divisée en 3 régions :

• La région extracellulaire qui consiste en l'extrémité N-terminale et 3 boucles extracellulaires (ECL1 - ECL3*). Cette région module l'accès du ligand.
• La région des hélices transmembranaires ("TM") qui consiste en 7 α-hélices (TM1 - TM7). Cette région constitue le noyau structurel, fixe les ligands et transduit cette information à la région intracellulaire via des changements de conformation.
• La région intracellulaire qui consiste en 3 boucles intracellulaires (ICL1 - ICL3), une hélice amphipathique intracellulaire (H8) et l'extrémité C-terminale. Cette région est l'interface avec les protéines de signalisation (cytosoliques ou membranaires).
• *Système de numérotation dit "Ballesteros - Weinstein" (Ballesteros & Weinstein, 1995, Methods Neurosci. 25, 366 - 428).

a. Région extracellulaire et poche de fixation du ligand

Les analyses des séquences montre une grande diversité dans les longueurs et les compositions en acides aminés de l'extrémité N-terminale et des boucles extracellulaires. Les structures de RCPG de la classe A révèlent 2 types de région extracellulaire : celles dont la poche de fixation du ligand est accessible à l'eau de ligands poche et celles dont la poche de fixation du ligand est inaccessible à l'eau (exemple : rhodopsine et récepteur S1P1).

Figure ci-dessous : comparaison de la profondeur des poches de fixation des ligands des RCPG de la classe A. L'hélice transmembranaire TM4 est utilisée comme référence.

Source : Venkatakrishnan et al. (2013)

La profondeur de pénétration du ligand est la plus grande pour la doxépine pour le récepteur de l'histamine H₁ et la moins grande pour la caféine pour le récepteur A_2AR.

Les étiquettes au dessus des structures indiquent la sous-classe des RCPG de la classe A.

Une autre caractéristique de la région extracellulaire est la présence de ponts disulfures qui contribuent à la stabilité du récepteur.

Le pont disulfure établi entre une Cys de TM3 (Cys^3.25 - numérotation Ballesteros - Weinstein) et ECL2 semble hautement conservé dans la plupart des structures des RCPG (sauf S1P1). Ce pont disulfure TM3 - ECL2 ancre la région extracellulaire de l'hélice près du site de fixation du ligand et limite l'ampleur des changements conformationnels de cette région au cours de l'activation du récepteur.

Plusieurs ECL3 contiennent un pont disulfure intra-boucle supplémentaire (motif Cx_nC) qui semble avoir une influence sur la fonction du récepteur en limitant les mouvements conformationnels de cette boucle. Par exemple, on a mis en évidence qu'une mutation faux-sens (C271R) de ce pont disulfure du récepteur de la mélanocortine-4 induit un dysfonctionnement du récepteur lié à l'obésité.

Voir un article très détaillé sur la structure et les rôles des boucles extra-cellulaires : Wheatley et al. (2012) "Lifting the lid on GPCRs: the role of extracellular loops" Br. J. Pharmacol. 165, 1688 - 1703

b. Repliement conservé de la région TM

Le faisceau d'hélices TM sert à la communication entre la poche de liaison du ligand et la région de couplage aux protéines G. Bien que l'ensemble des RCPG partagent une architecture similaire de 7 hélices TM maintenue par des contacts au niveau de la structure tertiaire, leurs séquences sont diverses.

Une analyse systématique des différentes structures de RCPG (incluant des RCPG dans l'état actif et inactif) a révélé un réseau consensus de 24 contacts inter-TM médiés par 36 acides aminés équivalents sur le plan topologique. L'importance de ces positions est confortée par le fait que des mutations dans 14 des 36 positions entraînent une augmentation ou une perte de l'activité des récepteurs.

Exemples d'acides aminés hautement conservés : Asn^1.50, Asp^2.50, Trp^4.50 and Pro^7.50

Source : Venkatakrishnan et al. (2013)

En termes de positionnement spatial au sein du récepteur, les contacts tertiaires consensus inter-TM sont en grande partie localisés au centre et du côté cytoplasmique de l'ensemble TM et regroupés en particulier aux interfaces TM1-TM2, TM3-TM4, TM3-TM5 et TM3-TM6-TM7.

c. Particularités de la région intracellulaire

Les résidus de la région intracellulaire et les extrémités cytoplasmiques des TM lient des effecteurs de signalisation tels que les protéines G, les kinases de GPCR et les arrestines. Dans les structures disponibles :

• ICL1 est généralement longue de six acides aminés et contient un tour d'hélice α
• ICL2 contient un ou deux tour(s) d'hélice α ou un ensemble d'acides aminés qui forment une région intrinsèquement non structurée

En plus des ICL, une hélice amphipathique courte (H8), contenant généralement trois tours d'hélice α et des sites de palmitoylation à son extrémité C-terminale, est présente dans plusieurs structures de GPCR de la classe A.

Source : Zheng et al., 2012

C^3.55 est le site de palmitoylation de OPRM1 (récepteur des μ-opioides).

La palmitoylation du récepteur facilite l'association du cholestérol pour former un complexe de signalisation [cholestérol-palmitoyl-OPRM1]. L'interaction cholestérol-palmitoyl contribue au mécanisme de signalisation de OPRM1 en facilitant son homodimérisation et son couplage avec les protéines G_αi2.

ICL3 et l'extrémité C-terminale sont des régions longues et variables. Elles sont probablement intrinsèquement non structurées chez beaucoup de GPCR. Les régions intrinsèquement non structurées exposent des motifs peptidiques linéaires qui reconnaissent des partenaires spécifiques, ce qui régule leur fixation et leur fonction.

Diverses kinases et le domaine tyrosine kinase du récepteur de l'insuline peuvent phosphoryler les régions cytoplasmiques des β-adréno-récepteurs. Les différentes formes phosphorylées de ces récepteurs établissent des interactions différentes avec la β-arrestine, ce qui influence l'activité du récepteur et l'internalisation à partir de la membrane.

d. Intermédiaires structuraux de l'activation d'un RCPG

Des intermédiaires clé du mécanisme d'activation des RCPG ont été caractérisés par cristallographie (figure ci-dessous).

• R′ : états inactifs de faible affinité lié aux agonistes. Ils diffèrent des états R par de petits changements conformationnels locaux de la poche de fixation du récepteur.
• R″ : le (ou les) état(s) activé(s) caractérisé(s) par des réarrangements globaux importants des hélices et des micro-mouvements des chaînes latérales du côté intracellulaire qui expose, au moins partiellement, la crevasse de fixation des protéines G.

Source : Katritch et al., 2013

• R* : sous-états activés après insertion de l'hélice α C-terminale d'une protéine G dans la crevasse intracellulaire.
• R*^G : conformation "signalisante" du récepteur après fixation et pleine activation du complexe [RCPG - protéine G_αβγ].
• R*^GRK et R*^A : états conformationnels (non représentés) du RCPG fixé aux kinases de ce RCPG ou à la β-arrestin.

5. Comparaison des conformations active et inactive d'un RCPG modèle

L'équipe de Brian Kobilka* a conçu un fragment d'anticorps de haute affinité qui stabilise la conformation active de β2AR (β2-adrénorécepteur). Les structures de β2AR lié à 3 agonistes chimiquement distincts ont été déterminées :

• BI-167107 : agoniste à ultra haute affinité (K_d = 84 pM)
• hydroxybenzyl isoprotérénol : agoniste catécholamine à haute affinité
• adrénaline : agoniste endogène de faible affinité

Cette technique a permis de comparer pour la première fois, les structures d'un récepteur adrénergique liés à des catécholamines dans ses conformations actives et inactives.

[*Robert Lefkowitz et Brian Kobilka ont reçu le prix Nobel de Chimie en 2012 pour leurs travaux sur les RCPG].

Les résultats indiquent que :

• La structure du récepteur β2AR est globalement la même qu'il soit lié à l'adrénaline ou aux 2 autres agonistes. Il y a cependant des réarrangements conformationnels importants de la boucle extracellulaire ECL3 et de l'extrémité extracellulaire de l'hélice 6 transmembranaire.
• La comparaison de ces structures révèlent également une liaison hydrogène médiée par l'eau entre deux tyrosines conservées qui semble stabiliser la conformation active de β2AR et d'autres RCPG.
• La comparaison des structures cristallines révèle un mécanisme de reconnaissance du ligand et d'activation hautement conservé malgré les structures chimiques distinctes des 3 ligands et des affinités qui s'échelonnent de 100 nM à ~ 80 pm.
• La structure de β2AR dans sa conformation active liée à l'adrénaline révèle un réseau étendu de contacts polaires reliant le site orthostérique à ECL2 et ECL3.
• La structure de β1AR thermostabilisé dans la conformation inactive liée à l'isoprénaline (analogue agoniste de catécholamines) révèle un réseau de contacts polaires beaucoup plus limité (figure ci-dessous) :

Source : Ring et al., 2013

• La conformation active (figure ci-dessous) est caractérisée par une contraction importante du site de fixation par rapport à la structure inactive (figure d) de β1AR.

Source : Ring et al., 2013

L'utilisation de 2 nano-anticorps (Nb80 qui se fixe à β2AR et Nb37 qui se fixe à la forme Gs dépourvue du nucléotide) ont apporté des preuves expérimentales qui renforcent l'hypothèse que les RCPG localisés dans les endosomes sont encore actifs.

RCPG et site de fixation orthostérique

Les agonistes orthostériques se fixent à un RCPG et induisent un changement conformationnel du RCPG ce qui déclenche la cascade de signalisation en aval.

• Les modulateurs allostériques positifs sont des ligands allostériques qui se fixent sur un site distinct du point de vue topographique de celui de l'agoniste orthostérique : il en résulte une augmentation de l'affinité et/ou de l'efficacité de l'agoniste orthostérique.
• A l'inverse, les modulateurs allostériques négatifs diminuent l'affinité et/ou l'efficacité de l'agoniste orthostérique.

Les ligands allostériques qui n'ont aucun effet sur l'affinité et/ou l'efficacité médiée par l'agoniste orthostérique sont appelés ligands allostériques neutres.

Source : Wootten et al., 2013

Les flèches rouges indiquent les interactions allostériques entre le modulateur et le ligand orthostérique. Les flèches noires indiquent les interactions allostériques entre les sites de fixation du ligand et le site de fixation de l'effecteur au sein du RCPG, qui entraînent l'activation des voies de signalisation, appelé aussi "agonisme orthostérique".

6. Comparaison des RCPG de la classe A et de la classe B

Le récepteur du glucagon (GCGR) est l'un des 15 membres des RCPG de la classe B ("secretin-like"). La fixation du glucagon au récepteur au GCGR libère le glucose du foie pendant le jeûne. Le GCGR joue donc un rôle important dans l'homéostasie du glucose.

Exemples de récepteurs de la classe B :

• glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor ou gastric inhibitory polypeptide receptor
• rat secretin receptor
• vasoactive intestinal peptide and pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor 1

Les principales différences entre le GCGR et les RCPG de la classe A sont :

• a. Une poche de fixation du ligand plus grande et plus profonde pour le GCGR.
• b. L'hélice I transmembranaire de l'extrémité N-terminale du GCGR se prolonge par une "tige" qui s'étend sur trois tours d'hélice (approximativement 16 Å) au-dessus du plan de la membrane. Cette tige positionne le domaine extracellulaire N-terminal (environ 12 kDa) par rapport à la membrane pour former le site de fixation du glucagon. Ce site facilite l'insertion de l'extrémité N-terminale du glucagon dans le domaine transmembranaire.

Source : Siu et al. (2013) - GCGR en bleu et RCPG de la classe A en gris.

Caractéristiques structurales des RCPG de la classe B

• les acides aminés Arg 201, Tyr 202, Asp 208 et Trp 215 stabilisent la conformation de ECL1 et/ou interagissent directement avec le glucagon
• ECL1 et ECL2 des RCPG des 2 classes sont stabilisées par un pont disulfure entre Cys 294 et Cys 224^3.29
• ECL1 et ECL2 des RCPG de la classe B semblent stabilisées aussi par d'éventuels ponts salins entre Lys 286^4.64 et Glu 290 et entre Asp 218 et Arg 225^3.30, respectivement
• ECL1 est formée de 16 acides aminés contre 4 à- 6 acides aminés pour la plupart des RCPG de la classe A
• l'hélice VIII intracellulaire à l'extrémité C-terminale du GCGR a une inclinaison par rapport à la membrane d'environ 25° comparativement à son inclinaison chez les récepteurs de la classe A (figure ci-dessus)
• Glu 406 de l'hélice VIII est conservé chez les récepteurs de la classe B et forme 2 ponts salins inter-hélicaux avec les acides aminés Arg 173^2.46 et Arg 346^6.37
• une glycine de l'hélice VII du GCGR fait partie du motif [FQG^7.50xxVxxxY^7.57CF] totalement conservé chez les récepteurs de la classe B. Cette glycine permet une courbure de l'hélice VII via l'interaction avec Phe 184^2.57de l'hélice II

Remarque : la nomenclature en vigueur pour les RCPG de la classe B est celle de Wootten et al. (2013).