1. Enoncé

2. Réponse partie A

3. Réponse partie B

4. Réponse partie C

a. Détermination de la masse molaire d'une molécule par filtration sur gel
b. Gel d'électrophorèse des protéines en conditions dénaturantes

c. L'électrophorèse sur gel bi-dimensionnel
d. Identificaton de l'extrémité N-terminale et carte peptidique

5. Réponse partie D

a. Rappels sur les hélices α
b. Rappel sur le dichroïsme circulaire

6. Liens Internet et références bibliographiques

1. Enoncé

L'endoprotéase L de Escherichia coli coupe les liaisons peptidiques entre les acides aminés Leu et X, X étant n'importe quel acide aminé.

Partie A

On teste plusieurs méthodes de purification de cette enzyme sur un extrait brut de E. coli. Les résultats sont les suivants :

Partie B

Pour purifier davantage l'enzyme, un gel d'affinité est synthétisé : une molécule Y est fixée de manière covalente sur de la sépharose et le gel Z est obtenu (structure ci-dessous).

Pourquoi ce gel permet-il de purifier davantage l'endoprotéase L ? Quel est le mode opératoire ?

Partie C

Une fois l'enzyme purifiée, elle est caractérisée par les techniques suivantes :

• L'analyse sur un gel Séphadex et la comparaison avec des protéines globulaires de masses molaires connues révèlent une masse molaire de 50 000 daltons pour l'endoprotéase L.
• On observe une bande correspondant à une masse molaire de 13 200 daltons sur gel d'électrophorèse sur polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS et β-mercaptoéthanol).
• En électrophorèse bidimensionnelle, deux tâches sont observées de masses molaires presque identiques mais de points isoélectriques légèrement différents (polypeptides A et B).
• A partir des deux spots obtenus en électrophorèse bidimensionnelle, l'extrémité N-terminale de chaque polypeptide est identifiée par une technique trés sensible : Asp pour le polypeptide A et Gly pour le polypeptide B.
• Une carte peptidique est obtenue à partir des deux spots. Les polypeptides A et B ne se distinguent que par un peptide dont la composition en acides aminés est :
  1. peptide provenant de A : Ala 1 / Tyr 1 / Gly 2 / Asp 1 / Lys 1 / Glu 1
  2. peptide provenant de B : Ala 1 / Tyr 1 / Gly 2 / Lys 1 / Glu 1

a. Rappeler le principe des techniques utilisées.
b. Citer une technique trés sensible pour déterminer l'extrémité N-terminale d'un polypeptide.
c. Quelle est la structure native de l'endoprotéase L ?
d. Expliquer la présence des polypeptides A et B ?

Partie D

Les polypeptides A et B ont une teneur en hélice α de 20 %.

a. Rappeler les caractéristiques des hélices α.
b. Quelle(s) technique(s) permet(tent) de déterminer le pourcentage en structures secondaires dans une protéine ?

2. Réponse partie A

Centrifugation en gradient de densité

La vitesse de sédimentation d'une particule (organite, macromolécule, ...) est fonction de la différence entre sa densité et celle du milieu ambiant.

Les variations de densités sont obtenues en faisant varier la concentration d'un produit chimique qui doit être très solubles dans l'eau. Divers produits peuvent être utilisés pour faire ces gradients.

La vitesse de sédimentation peut donc être modifiée en faisant varier de façon continue ou discontinue (par paliers) cette différence en créant un gradient de concentration du milieu ambiant.

• 1er cas : aucune différence de densité, il n'y a pas de sédimentation quelle que soit l'accélération.
• 2ème cas : la densité de la édimentation d'autant plus rapide que la différence de densité est grande.
• 3ème cas : la particule s'élève jusqu'à ce qu'elle atteigne une densité du milieu ambiant identique à la sienne (elle peut éventuellement flotter).

Source : "Centrifugation en gradient de densité"

Chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel

Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première approximation sur la masse molaire des molécules à séparer.

En toute rigueur, le paramètre physico-chimique qui intervient est la dimension des molécules, donc leur volume et donc plus précisément leur rayon de Stokes. Mais cette relation univoque [masse molaire - rayon de Stokes] n'est valable que pour des protéines dites "globulaires", c'est-à-dire assimilées à des sphères

Différents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent fausser la détermination de la masse molaire réelle par ce type de chromatographie :

• la géométrie : pour une même masse molaire, une protéine "allongée" (exemple, la calmoduline) n'aura pas les mêmes dimensions qu'une protéine globulaire.
• les modifications post-traductionnelles : par exemple, les longues chaînes d'oses modifient fortement la géomètrie des protéines glycosylées et les rend plus denses ; à l'inverse, les lipoprotéines sont "allégées" par la présence de lipides.
• la présence de sels, d'agents chaotropiques, de détergents ... 

La phase stationnaire est constituée de billes de polysaccharides (type "Sephadex™") gonflées dans le solvant utilisé pour l'élution :

• le volume des billes est très finement calibré
• ainsi les molécules dont le volume est supérieur à celui des billes ne peuvent y pénétrer et sont éluées rapidement
• en revanche, les molécules dont le volume est inférieur à celui des billes y pénétrent et y subissent des frottements qui les retardent

Chromatographie d'échange d'ions

Les échangeurs d'ions sont des billes qui portent des groupements ionisables dont la charge est :

Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé :

• dans le cas d'une base (échangeur d'anions), le pH doit être inférieur au pK_a du groupement ionisable (exemple : le pK_a du groupement diéthylaminoéthylammonium est 9,5)
• dans le cas d'un acide (échangeur de cations), le pH doit être supérieur au pK_a du groupement ionisable (exemple : le pK_a du groupement carboxyméthyl est 4)

• négative : le pI de l'albumine de sérum bovin est 4,9, cette protéine est chargée négativement à pH 7
• nulle
• positive : le pI du cytochrome c est 10,7, cette protéine est chargée positivement à pH 7

  Il y a deux manières d'éluer les molécules fixées sur la résine :

• En modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que l'échangeur d'ions) ; il n'y a plus alors d'interaction électrostatique entre les molécules et le groupement chargé porté par la résine et les molécules sont éluées.
• En ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion de même charge que les molécules fixées à la résine : cet ion s'appelle un contre - ion. Il y a compétition entre le contre-ion et la molécule fixée sur le gel pour les sites de fixation sur ce gel.

• cations monovalents : Li⁺ < H⁺ < Na⁺ < NH₄⁺
• cations divalents : Cd₂⁺ < Mn₂⁺ < Mg₂⁺ < Zn₂⁺ < Cu₂⁺ < Ca₂⁺ 
• de plus, l'efficacité augmente avec la charge : K⁺ < Ca₂⁺ < Al₃⁺  

Qu'il s'agisse du rendement et du facteur de purification, la méthode la plus performante dans l'exemple présent est la chromatographie d'échange d'ions DEAE-cellulose.

Le gradient de saccharose et la chromatographie sur gel séphadex G200 donnent les mêmes valeurs : un bon rendement (bien qu'inférieur) et un facteur de purification nettement moindre.

Le gradient de saccharose est le moins sélectif du fait de la taille des tubes et du principe même de la technique, surtout quand il s'agit d'un extrait brut.

La chromatographie sur gel de filtration est une technique trés délicate : elle nécessite des colonnes particulières (trés longues et de section trés petite) afin d'augmenter le nombre de plateaux théoriques de fractionnement des protéines et elle doit être réalisée à un débit trés faible.

Pour qu'une de chromatographie sur gel de filtration soit efficace, il faut que l'échantillon soit le plus concentré possible. Il en va de même pour le gradient de saccharose où l'on ne peut utiliser un grand volume d'échantillon.

Après une chromatographie d'échange d'ions, il faut se débarasser du sel qui a servi à éluer la protéine. Pour celà, il faut dialyser les fractions qui contiennent la protéine éluée. La dialyse entraîne une dilution. Il faut alors concentrer l'échantillon (précipitation au sulfate d'ammonium / concentration sur membrane).

Or la dialyse et la concentration entraînent de fortes pertes de protéines (exemple : le trés mauvais rendement de l'étape de précipitation au sulfate d'ammonium - tableau ci-dessus).

En conséquence, il est préférable de faire d'abord le gradient de saccharose ou la chromatographie sur gel de filtration puis la chromatographie d'échange d'ions.

3. Réponse partie B

Le gel Z est un gel d'affinité.

La molécule Y est un analogue structural de la leucine qui est le substrat de l'endoprotéase L de E. coli puisque cette dernière hydrolyse les liaisons peptidiques entre les acides aminés Leu et X.

La molécule Y (c'est-à-dire le bras du gel d'affinité) peut donc se fixer au niveau du site actif de de l'endoprotéase L sans pour autant être hydrolysé puisqu'il n'a pas une structure rigoureusement identique à celle du substrat.

La chromatographie d'affinité est le type de chromatographie le plus sélectif, une protéine pouvant être purifiée d'un facteur 10³ à 10⁴ en une seule fois.

Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur la reconnaissance entre une molécule du mélange à séparer et une molécule greffée sur la résine, que l'on appelle le ligand, ces deux molécules interagissant de manière hautement spécifique :

• L'adsorption de la molécule à séparer sur le ligand fixé à la résine est effectuée dans des conditions physico-chimiques (pH, force ionique, concentration de la molécule à adsorber...) favorables à la liaison molécule - ligand.
• Dans ces conditions, les molécules du mélange à séparer qui n'ont pas (ou peu) d'affinité pour le ligand sont éluées au fur et à mesure qu'on le fait passer sur la résine.
• On désorbe ensuite les molécules spécifiquement fixées au ligand en modifiant les conditions physico-chimiques de telle sorte que la liaison molécule - ligand soit rompue : le plus souvent, on ajoute une tierce molécule qui entre en compétition avec la molécule à séparer pour le ligand greffé.

En d'autres termes, on favorise l'équilibre molécule - [tierce molécule].

Cette tierce molécule peut-être :

• le ligand greffé lui-même (sous forme libre) à une concentration plus élevée que celle du ligand greffé
• une molécule dont la structure est analogue à celle du ligand greffé mais pour laquelle la molécule a plus d'affinité

Structure de gels d'affinité - Activation du gel pour le couplage du ligand - Bras espaceurs

Les supports ou matrices utilisés pour la chromatographie d'affinité peuvent être des billes d'agarose (Sepharose), de polyacrylamide d'agarose, de verre poreux, de polyvinyle, de polyméthacrylate ...

L'immobilisation du ligand sur la matrice nécessite qu'il soit préalablement activé, c'est-à-dire qu'il faut créer des sites réactionnels qui permettent d'établir des liaisons covalentes.

Parmi les diverses méthodes d'activation, on peut citer :

• L'activation des groupes hydroxyles du support (l'agarose par exemple) par le bromure de cyanogène dans une solution dont le pH est finement contrôlé (pH 8,3). Des groupements imidocarbonates sont formés sur lesquels on peut fixer des ligands contenant des amines libres, par exemple une protéine par la chaîne latérale de ces lysines. Les groupes hydroxyles qui n'ont pas réagit sont bloqués par action de l'éthanolamine ou la glycine.
• Les groupes hydroxyles du support peuvent être activés par le carbonyl di-imidazole.
• L'activation du support peut être faite avec le gtutaraldéhyde qui se polymérise et forme des chaînes à 5 carbones qui constituent des points de fixation à une certaine distance de la matrice.
• Une autre méthode d'activation utilise le chlorure de tosyle et elle permet le couplage de molécules qui possèdent un groupement aminé, thiol ou phénol.

La chromatographie d'affinité est la méthode la plus sélective. Cependant, c'est aussi la plus délicate à mettre en oeuvre car elle nécessite la mise au point des conditions expérimentales idoines pour obtenir un gel correctement activé : 

• Le ligand doit être orienté de manière optimale pour une parfaite reconnaissance stéréochimique de la molécule que l'on veut séparer.
• Il ne faut pas que le ligand subisse l'action des enzymes, c'est pour celà qu'on utilise davantage des analogues de substrats (inhibiteurs compétitfs par exemple) que les substrats eux-mêmes.
• Il faut trouver des conditions d'élution de la molécule fixée au ligand qui préserve sa fonction biologique.
• En conséquence, cette méthode chromatographique est coûteuse.

4. Réponse partie C

a. Détermination de la masse molaire d'une molécule par filtration sur gel

1. Un mélange de molécules que l'on appelle standards, de masses molaires connues, est séparé par chromatographie sur gel de filtration (pics d'élution 1 à 7, figure ci-dessous).

Source : Chromatographie (Waters®)

2. Chaque molécule (caractérisée, par exemple, par un pic d'absorbance) a un volume d'élution V_e.

3. Le volume d'exclusion du gel (V₀) est le volume d'élution d'une molécule non retardée, c'est-à-dire une molécule de taille supérieure au diamètre des pores des billes du gel et qui n'y diffuse donc pas. Bien souvent, on utilise le bleu dextran, polymère d'ose de masse molaire supérieure à 2 10⁶ Da.

4. Le volume total du gel (V_t) est la somme du volume des billes et du volume externe aux billes. Il est donné par le volume d'élution d'une molécule qui diffuse totalement dans les billes (donc totalement retardée), ici la ruonosine.

5. A partir du profil d'élution des standards, on trace la la droite étalon : V_e / V₀ = f log (masse molaire).

6. Dans les mêmes conditions de chromatographie que pour le mélange des standards, on détermine le volume d'élution d'une molécule inconnue.

7. On reporte la valeur du rapport V_e / V₀ de la molécule inconnue sur la droite étalon et on détermine ainsi sa masse molaire.

b. Gel d'électrophorèse des protéines en conditions dénaturantes

La technique du gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes ("sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis" ou SDS-PAGE) a été décrite par Ulrich Laemmli en 1970.

C'est l'une des techniques (et donc l'un des articles) les plus cité(e)s dans la littérature scientifique : Laemmli, U. K. (1970) "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4" Nature 227, 680 - 685.

On fait bouillir un mélange de protéines en présence :

• d'un agent réducteur : le β-mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures.
• d'un détergent anionique fort : le sodium dodecyl sulfate (SDS) qui enveloppe les chaînes polypeptidiques des protéines de charges négatives. Ces charges se repoussent er déplient les chaînes polypeptidiques.

En conséquence :

• les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native
• les protéines n'ont plus de pont disulfure : elles sont sous une forme monomérique

Les protéines de l'échantillon sont ensuite séparées par une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.

C'est un gel réticulé, obtenu par polymérisation d'acrylamide qui forme des chaînes et de bis-acrylamide qui ponte les chaînes d'acrylamide.

La réaction de polymérisation est :

• initiée par la formation de radicaux libres par le persulfate d'ammonium
• catalysée par le TEMED (N,N,N',N'-tétramethyl-1-,2-diaminométhane - toxique)

Plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, plus la densité des chaînes est élevée et les mailles du réseau sont serrées.

En conséquence :

• plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, moins les molécules volumineuses peuvent migrer
• une protéine globulaire (assimilable à une sphère) migre d'autant moins que sa masse molaire est élevée

On obtient différentes bandes pour chaque piste de la figure ci-dessous (la flèche indique le sens de migration).

Source : E. Jaspard (2004)

La masse molaire des protéines est déterminée à l'aide de marqueurs qui sont des protéines standards de masses molaires connues (piste de droite).

Exemple de marqueurs : myosine (205 kDa), β galactosidase (116 kDa), phosphorylase b (97,4 kDa), albumine (66 kDa), ovalbumine (45 kDa), anhydrase carbonique (29 kDa).

Détermination de la masse molaire d'une protéine

• La mobilité relative est le rapport (distance de migration d'une bande / distance de migration du front de migration).
• La droite : log (masse molaire) = f(mobilité relative) permet de déterminer la masse molaire d'une protéine inconnue (figure ci-dessous).

c. L'électrophorèse sur gel bi-dimensionnel (2DPAGE : "two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis")

C'est la technique de base en protéomique.

La stratégie la plus courante est de séparer dans un premier temps les protéines par électrophorèse bidimensionnelle en gel de polyacrylamide. Du fait de leur composition en acides aminés, les protéines diffèrent les unes des autres par :

• Leur masse molaire.
• Leur charge nette à un pH donné. Cette valeur est caractérisée par le point isoélectrique ou pI.

Les protéines ont :

• Des pI qui s'échelonnent de 2 (glucose-1-phospho-D-mannosylglycoprotéine phosphodiestérase) à 12 (cathepsine G).
• Des masses molaires de 5 kDa à 590 kDa (calossine - 5322 acides aminés).

L'une des difficultés majeures de la séparation est de trouver des conditions d'électrophorèse qui couvrent de telles gammes de propriétés physico-chimiques.

La séparation se fait en deux temps :

Source : Humboldt - Universität Berlin

• 1ère dimension : une isoélectrofocalisation (IEF) où les polypeptides migrent jusqu'à un pH égal à leur pl. La séparation selon la charge utilisait auparavant des ampholytes pour obtenir un gradient de pH. Mais ce procédé n'étant pas assez reproductible pour la comparaison de gels par superposition, on utilise maintenant des gradients de pH immobilisés (IPG), préformés dans des gels commerciaux. Ces molécules, les immobilines, co-polymérisent avec les molécules d'acrylamide dans le gel d'IEF. Ce choix permet d'obtenir des gradients de pH très étroits.

• 2ème dimension : une séparation selon la masse molaire est un gel d'électrophorèse de polyacrylamide en conditions dénaturantes (sodium dodécyl sulfate / réduction des ponts disulfures).

Ces deux électrophorèses sont effectuées de manière perpendiculaire l'une par rapport à l'autre. Comme les paramètres de la séparation sont indépendants, cette technique est particulièrement résolutive : plusieurs centaines de chaînes polypeptidiques peuvent être séparées sous forme de taches de protéines ou spots sur un gel.

Voir des exemples de gels bi-dimensionnels.

Coloration des gels pour la révélation des protéines (100 ng à 0,1 ng de protéine par spot) :

• Bleu de coomassie : 30 - 50 ng, faible sensibilité
• bleu colloïdal : 5 à 10 fois plus sensible
• nitrate d'argent : forte sensibilité (0,1 ng) (photo de droite ci-dessous)
• fluorophore "Sypro Ruby" : forte sensibilité (1 à 10 ng) (photo de gauche ci-dessous)

Source : Sigma - Aldrich

Les logiciels d'analyse d'image des gels repèrent les spots et calculent leur coordonnées et leur intensité. La sélection des spots à prélever est transmise au couteau à gel. Les morceaux de gels sont déposés dans les puits de plaques à 96 puits.

d. Identificaton de l'extrémité N-terminale et carte peptidique

On détermine le résidu N-terminal d'une protéine en faisant agir, par exemple le chlorure de dansyle (DNS) (réactif fluorescent), le chlorure de dabsyle (réactif fluorescent), le 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (réactif de Sanger), l'isocyanate de methyle, la fluorescamine.

• L'acide aminé en position N-terminale du polypeptide A est Asp.
• L'acide aminé en position N-terminale du polypeptide B est Gly.

La carte peptidique est obtenue après digestion du polypeptide par une protéase (exemple : trypsine). La séparation des peptides issus de cette hydrolyse est effectuée par électrophorèse en conditions dénaturantes suivie d'une chromatographie de partage.

La technique la plus récente (appliquée en protéomique) est la spectromètrie de masse en tandem ou non.

Comme l'indique la composition en acides aminés, le peptide provenant du polypeptide A ne diffère du peptide provenant du polypeptide B que par un Asp : il est donc plus négatif et plus hydrophile.

En conséquence, les polypeptides A et B ne diffèrent que par leur extrémité N-terminale :

• polypeptide A : Asp - Gly - X-X-X-X ....
• polypeptide B :          Gly - X-X-X-X ....

On peut supposer que les polypeptides A et B résultent de la duplication d'un gène ancestral unique puis divergence des 2 copies qui a entraîné la perte de l'acide aminé N-terminal Asp dans le polypeptide B.

La masse molaire des polypeptides A et B est si proche que l'on observe qu'une bande sur gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes.

Structure de l'endoprotéase L de E. coli

• chromatographie gel séphadex G200 : masse molaire native = 50 000 Da
• gel d'électrophorèse des protéines en conditions dénaturantes : une bande de masse molaire = 13 200 Da

L'endoprotéase L de E. coli est donc un tétramère qui pourraient être [2 chaînes polypeptide A + 2 chaînes polypeptide B].

5. Réponse partie D

a. Rappels sur les hélices α

Deux hélices α adjacentes sont généralement arrangées de manière antiparallèle. Elles sont compactées par les liaisons hydrogène qui s'établissent entre les chaînes latérales des acides aminés.

Ces paires (ou unités) sont souvent arrangées en faisceau à 4 hélices dans lequel les chaînes latérales des 4 hélices α sont empilées et forment un coeur hydrophobe au centre du faisceau.

Les faisceaux à 4 hélices forment des domaines α dans les protéines. La myohémérythrine, le cytochrome b562, la petite protéine Rop qui se lie à l'ARN, sont des protéines de ce genre.

b. Autres types d'hélices

Hélice 3₁₀

• constituée de trois résidus par tour et avec 10 atomes entre le donneur et l'accepteur de liaison hydrogène
• les liaisons hydrogène ne sont pas linéaires : cette structure est donc trés dense et implique généralement un petit nombre d'acides aminés
• rarement trouvée dans les protéines (protéines qui contiennent un acide aminé rare : l'acide α-amino butyrique - certaines extrémités d'hélice α)

Hélice π

• jamais observé dans les protéines
• beaucoup moins compacte
• un trou au centre
• pas de contact entre les atomes de la chaîne principale

c. Récapitulatif : voir la méthode du diagramme de Ramachandran pour une définition des angles.

Script Python pour représenter les diagrammes à partir d'un fichier de la PDB.

d. Rappel sur le dichroïsme circulaire

Le dichroïsme circulaire s'appuie sur la capacité des molécules qui ont une activité optique d'absorber différemment à droite et àgauche la lumière polarisée circulairement.

L'activité optique est la propriété que possède une structure chirale d'interagir avec un rayonnement électromagnétique.

Le dichroïsme circulaire est une technique qui permet d'analyser le contenu en structures secondaires des protéines ou des acides nucléiques. Pour déterminer la proportion de chaque type de structure secondaire, il faut effectuer une déconvolution en composantes élémentaires du spectre de dichroïsme avec des logiciels appropriés.

Cette une technique non destructive qui permet d'étudier les changements de conformation des protéines dans différents environnements (pH, agents dénaturants, température).

b. Lumière polarisée

Certaines propriétés de la lumière sont celles d'une onde électromagnétique :

• il s'agit d'une onde transversale
• le vecteur champ électrique E de l'onde est perpendiculaire à la direction de propagation
• celle-ci se confond, avec le rayon lumineux dans l'approximation de l'optique géométrique

Dans la lumière naturelle, le vecteur E peut prendre toutes les directions perpendiculaires à la direction de propagation.

• Une lumière est polarisée rectilignement quand E vibre toujours dans un même plan appelé plan de vibration.
• Le plan perpendiculaire à E dans lequel vibre le champ magnétique B est appelé plan de polarisation.
• Un polariseur est un instrument d'optique qui sélectionne parmi toutes les directions permises pour le champ électrique celles qui sont parallèles à son axe de polarisation.

c. Spectres de dichroïsme circulaire

La forme du spectre obtenu pour une protéine peut être déconvoluée (décomposée) en différentes composantes. Chaque composante donne une courbe spectrale caractéristique (figure ci-dessous) :

Source : Mile & Wallace (2006)

• rouge : spectre de la myoglobine, protéine essentiellement composée d'hélices α.
• bleu : spectre de la concanavaline, protéine essentiellement composée de feuillets β.
• jaune : spectre du collagène de type VI , protéine essentiellement composée d'hélices polyproline II.