1. Introduction

2. Les indices de mesure de la promiscuité enzymatique

a. Paramètres cinétiques
b. Illustration des métallo-β-lactamases

3. Facteurs responsables de la promiscuité enzymatique

4. Exemples de promiscuité enzymatique

a. Divers types de promiscuité
b. Autres exemples
c. Prédiction d'enzymes promiscueuses à partir de modèles métaboliques

5. La reconstruction (ou résurrection) de protéines ancestrales

a. Principe
b. Illustration : reconstruction de β-lactamases ancestrales

6. Liens Internet et références bibliographiques

1. Introduction

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques remarquablement spécifiques.

Cependant, de nombreuses enzymes sont capables de catalyser d'autres réactions et/ou de transformer d'autres substrats que celles/ceux pour lesquels elles sont physiologiquement spécialisées : c'est la promiscuité enzymatique ("enzyme promiscuity").

L'un des premiers liens entre promiscuité enzymatique et évolution des protéines a été établi par R.A. Jensen (1976) qui a émis l'hypothèse que les enzymes primordiales (ancestrales), en petit nombre, devaient posséder des spécificités de substrats larges (conférant ainsi de nombreuses capacités métaboliques) contrairement aux enzymes actuelles, pour la plupart hautement spécifiques.

Voir un cours sur le monde à ARN.

La relation entre l'activité catalytique et l'espace des séquences en acides aminés peut être représentée comme un "paysage catalytique" (pic = activité catalytique élevée et vallée = activité catalytique faible).

Source : Baier & Tokuriki (2014)

• Certaines régions peuvent se recouvrir : elles correspondent à un ensemble de séquences qui peuvent catalyser 2 réactions enzymatiques (promiscuité catalytique).
• Ces recouvrements traduisent la possibilité qu'ont certaines protéines en général (certaines enzymes en particulier) d'évoluer vers de nouvelle(s) fonction(s) au travers d'un espace de séquences fonctionnelles.
• voir un développement de ces concepts et la notion d'épistasie : Kaltenbach & Tokuriki (2014).

On trouve fréquemment le terme anglo-saxon "promiscuous enzyme" que l'on peut traduire par "enzyme promiscueuse".

• Il est probable que la diversité génétique qui débouche sur les enzymes promiscueuses résulte de duplications et de mutations de leurs gènes qui évoluent vers de nouvelles enzymes aux fonctions diversifiées.
• La promiscuité enzymatique est la clé de l'évolutivité : elle est donc un point de départ vers de nouvelles protéines (enzymes), donc de nouvelles fonctions (activités).
• Les technologies à haut débit et la détection accrue d'enzymes promiscueuses ouvrent des perspectives en biologie synthétique : en effet, il est possible d'envisager la construction, avec des techniques d'évolution dirigée, de nouvelles voies métaboliques utilisant des catalyseurs dérivés de ces enzymes.

La promiscuité n'est pas réservée aux enzymes : chaque macromolécule dans une cellule peut établir des interactions promiscueuses avec de multiples molécules.

• Une simulation du cytoplasme surpeuplé ("macromolecular crowding effects") d'Escherichia coli avec les 50 macromolécules les plus abondantes suggère que les protéines ont environ 25 voisins à tout moment et rencontrent plus de 100 molécules différentes en 15 μs.
• La promiscuité ne semble pas un phénomène exceptionnel : plus d'un tiers des poches de fixation des ligands des protéines de la PDB sont promiscueuses et interagissent avec de multiples ligands chimiquement différents.

Différence entre promiscuité enzymatique et protéines "moonlighting"

La promiscuité enzymatique met en jeu le même site actif pour les différentes activités tandis que les fonctions des protéines "moonlighting" s'appuient sur différents sites de ces protéines.

De plus, il est probable que le désordre structural joue un rôle plus important dans la promiscuité enzymatique car elle nécessite qu'un même site de fixation reconnaisse et fixe des substrats très différents.

La promiscuité enzymatique est également différente des pseudoenzymes.

2. Les indices de mesure de la promiscuité enzymatique

a. Paramètres cinétiques

L'amplitude de la promiscuité enzymatique fait référence aux paramètres cinétiques qui caractérisent l'activité d'une enzyme promiscueuse par rapport à l'activité de l'enzyme native.

Sources : Figure A - Arora et al. (2014); Figure B - Khersonsky & Tawfik (2010)

La détoxification des médicaments par certaines enzymes et transporteurs de médicaments illustre bien ces notions. En effet, ces types de protéines doivent reconnaître des substrats d'une grande diversité structurale : les mécanismes de l'évolution ont probablement sélectionné des structures enzymatiques caractérisées par des valeurs de (k_cat/K_M) en adéquation avec cette large gamme de substrats, plutôt que d'optimiser une valeur de (k_cat/K_M) pour chaque substrat.

• La majorité des enzymes natives ont des valeurs de (k_cat/K_M) de l'ordre de 10³ à 10⁸ M^-1.s^-1 : l'amplitude de ce rapport pour les enzymes promiscueuses couvrent des ordres de grandeur encore plus larges.

• Les activités mesurées avec la phosphosérine des enzymes promiscueuses YtjC ("Probable phosphoglycerate mutase GpmB"), HisB ("Histidine biosynthesis bifunctional protein HisB") et Gph (phosphoglycolate phosphatase, détoxification du 2-phosphogycolate) correspondent à des valeurs de (k_cat/K_M) = 0,8, 1,6 et 7,6 M^-1.s^-1, respectivement, tandis que la valeur de (k_cat/K_M) de SerB (la phosphosérine phosphatase physiologique) est 8,7 10⁴ M^-1.s^-1.

• A l'inverse, certaines activités promiscueuses peuvent être relativement efficaces. Par exemple, l'homosérine kinase ThrB d'Escherichia coli phosphoryle l'homosérine (précurseur de la thréonine) avec une valeur de (k_cat/K_M) = 3,8 10⁵ M^-1.s^-1 et elle catalyse aussi la phosphorylation de la 4-hydroxythréonine avec une valeur de (k_cat/K_M) = 4,8 10³ M^-1.s^-1.

Le paramètre accélération de la vitesse (k_cat/k_{non catalysée}) permet d'apprécier l'amplitude des effets de la promiscuité sur les propriétés catalytiques.

Le paramètre compétence catalytique [(k_cat/K_M)/k_{non catalysée}] :

• Il traduit la force d'association d'une enzyme avec l'état de transition d'un substrat.
• Des études d'effets des isotopes permettent ainsi de mesurer l'énergie libre de l'interaction entre les résidus d'acides aminés d'un même site actif et divers états de transition issus de substrats différents (voir van Loo et al., 2019).

b. Illustration des métallo-β-lactamases

Les métallo-β-lactamases (MBL, E.C. 3.5.2.6, hydrolases dépendantes de l'ion mono- ou di-zinc) confèrent une résistance des bactéries à presque tous les antibiotiques β-lactamines. Les membres de la superfamille MBL ont des séquences et des fonctions sensiblement divergentes.

• Plus de 36.000 séquences d'acides aminés sont recensées dans la base de données des familles de protéines (Pfam PF00144). L'identité de ces séquences est inférieure à 5%.
• Cependant les membres de la superfamille MBL ont des caractéristiques structurales communes telles que le motif super-seconsaire αββα (repliement MBL) et un centre actif mono- ou binucléaire avec un motif de liaison au métal H₁₁₆XH₁₁₈XD₁₂₀.

Au moins 24 familles avec des fonctions distinctes ont été identifiées au sein de la superfamille MBL : ces fonctions sont aussi diverses que le traitement de l'ADN, des ARN et des nucléotides, la détection de concentration critique d'autoinducteur dans l'environnement extracellulaire et l'activation de la transcription, la détoxification, la résistance aux antibiotiques, l'hydrolyse des pesticides…

Figure ci-dessous : paramètres cinétiques de 20 activités natives et 36 activités promiscueuses de MBL. Les rapports de la médiane des activités natives vs. promiscueuses sont respectivement 1200 pour k_cat (10 s^-1 vs. 8 10^-3 s^-1), 5 pour K_M (0,46 mM^-1 vs. 7,5 mM^-1) et 4400 pour le rapport (k_cat/K_M) (1,9 10⁴ M^-1.s^-1 vs. 4,3 M^-1.s^-1).

Source : Baier & Tokuriki (2014)

3. Facteurs responsables de la promiscuité enzymatique

Plusieurs mécanismes moléculaires induisent la promiscuité enzymatique : certains sont intrinsèques au mécanisme de l'enzyme promiscueuse et d'autres sont intrinsèques au partenaire qui interagit avec l'enzyme.

L'ajustement induit ("induced fit", IF) et la sélection de conformations ("selected fit" ou "conformational selection", CS ou ) sont 2 modèles qui décrivent la fixation d'un ligand sur une protéine en général (d'un substrat sur une enzyme en particulier). Les enzymes de détoxication promiscueuses :

• Exploitent l'IF (comme les enzymes spécifiques d'un substrat) mais uniquement pour conserver la capacité de fixer une large gamme de substrats sur leur site actif.
• Exploitent la CS pour fixer une large gamme de substrats. Il est à noter que la CS n'offre pas d'avantage catalytique aux enzymes spécifiques d'un substrat.

a. Les modifications post-traductionnelles

Par exemple, les modifications par les protéines SUMO.

b. Les domaines structuraux multiples

Les domaines structuraux permettent aux protéines d'avoir plusieurs fonctions. Ils enrichissent le répertoire fonctionnel d'une superfamille protéique et génèrent des chaînes polypeptidiques qui peuvent accomoder une large gamme de partenaires moléculaires.

En raison de leur modularité dans la structure des protéines (donc des enzymes), les domaines peuvent être considérés comme les unités par lesquelles les protéines évoluent. Certains domaines ne sont présents qu'en combinaisons spécifiques. D'autres domaines sont présents dans diverses architectures protéiques et contribuent à leur diversité : ce sont des domaines que l'on peut qualifier de promiscueux.

c. L'état d'oligomérisation

Il détermine la fonction des protéines. Par exemple, la pyruvate kinase sous forme de tétramère est une enzyme de la glycolyse et sous forme de monomère c'est une protéine de fixation d'hormone thyroïdienne.

d. La reconnaissance partielle

Des modifications conformationnelles du site de fixation ne sont pas toujours nécessaires pour la promiscuité enzymatique. La reconnaissance moléculaire peut être partielle et résulter d'une complémentarité imparfaite entre l'enzyme et son ligand. La reconnaissance partielle est un mécanisme d'autant plus probable que de nombreuses enzymes catalysent des réactions impliquant une famille de ligands avec des efficacités catalytiques différentes.

e. Les sites d'interactions multiples

L'existence de plusieurs sites de fixation ou la possibilité de fixer plusieurs ligands sur un seul site sont les principaux facteurs de la promiscuité enzymatique.

• Ce mécanisme a un avantage sur la flexibilité conformationnelle lorsque des structures différentes doivent être reconnues (comme dans le cas des anticorps) : il évite que la chaîne polypeptidique ait à adopter plusieurs repliements (dont certains pourraient être impossibles) à partir d'une seule séquence en acides aminés.
• Les interactions allostériques facilite la promiscuité enzymatique sur de longues distances structurales : certaines mutations qui modulent la promiscuité enzymatique peuvent être éloignées du site actif.

f. La spécificité de cofacteurs large

• L'enzyme NDM-1 ("New Delhi metallo beta lactamase NDM1") de Klebsiella pneumoniae hydrolyse et dégrade de très nombreux antibiotiques à base de β-lactame en utilisant différents co-facteurs métalliques via différents mécanismes.
• La promiscuité des enzymes de détoxification est fréquemment associée à l'utilisation de cofacteurs polyvalents hautement réactifs et à un haut degré de flexibilité de la structure protéique.

g. La flexibilité structurale et la plasticité du site actif des enzymes

C'est le mécanisme le plus important pour rendre compte de la promiscuité enzymatique.

• La théorie de l'ajustement induit reste valable. Mais le paysage énergétique qui caractérise le repliement des protéines contient de nombreux minima locaux. En présence d'un ligand (dont la conformation peut aussi fluctuer), l'une des conformations préexistantes d'une protéine peut être favorisée : l'équilibre d'association entre la protéine et son partenaire moléculaire est alors déplacé vers la formation d'un complexe privilégiant cette conformation.

• Cependant, l'abondance de changements conformationnels associés à la reconnaissance moléculaire ne favorise pas toujours la promiscuité enzymatique. En effet, les changements conformationnels peuvent être sélectionnés par l'évolution sur la base de leur capacité à améliorer la spécificité de reconnaissance malgré des interactions " concurrentes".

Illustration

Il existe plusieurs sous-sites au sein du site actif de certaines enzymes promiscueuses. Par exemple, l'enzyme PON1 ("serum paraoxonase/arylesterase 1") du sérum possède plusieurs activités catalytique :

• activité "quorum-quenching N-acyl-homoserine lactonase" (E.C. 3.1.1.81) : N-acyl-L-homosérine lactone + H₂O <=> N-acyl-L-homosérine + H⁺
• activité arylesterase (E.C. 3.1.1.2) : un groupe phényl acétate + H₂O <=> un groupe phénol + acétate + H⁺
• activité aryldialkylphosphatase (E.C. 3.1.8.1) : aryl-dialkyl phosphate + H₂O <=> dialkyl phosphate + aryl alcool

L'hydrolyse de la lactone (activité native lactonase) est médiée par un mécanisme impliquant une histidine. L'activité promiscueuse phospho-triestérase médiée par d'autres résidus du site actif.

4. Exemples de promiscuité enzymatique

a. Divers types de promiscuité

Le terme promiscuité a 3 acceptions principales dans la littérature :

• Promiscuité de substrat (on trouve aussi le terme "substrate ambiguity") : enzymes à large spécificité de substrat : Exemples : transaminase TyrB (E.C. 2.6.1.57); L'histone méthyltransférase "Polycomb repressive complex-2" (PRC2) et différents ARN.

• Promiscuité catalytique : enzymes qui catalysent des réactions supplémentaires à la réaction "principale". Exemple : cytosine méthyltransférases capables de catalyser la méthylation et la désamination de la cytosine.

• Promiscuité de conditions (ou conditionnelle) : enzymes qui ont une activité catalytique différente de leur activité catalytique "naturelle" quand elles sont dans des conditions de réaction différentes (milieu anhydre, températures ou pH extrêmes, ...) ou pour d'autres causes : augmentation de la concentration d'un analogue de substrat avec une affinité plus faible pour l'enzyme, modifications post-traductionnelles ... Exemple : thymidine kinase (E.C. 2.7.1.21).

Source : Piedrafita et al. (2015)

Différentes définitions / classifications de la promiscuité enzymatique : Copley S.D. (2003), Bornscheuer & Kazlauskas (2004), Mariuzza R.A. (2006), Hult & Berglund (2007), Nobeli et al. (2009).

b. Autres exemples d'enzymes qui catalysent 2 réactions

Enzyme rhamnulose-1-phosphate aldolase (E. coli b3902, rhaD, E.C. 4.1.2.19) :

• Réaction R02263 : L-rhamnulose 1-phosphate <=> glycerone phosphate + (S)-lactaldéhyde
• Réaction R01785 : L-xylulose 1-phosphate <=> glycerone phosphate + glycolaldéhyde

Enzyme beta-cétoacyl-acyl-carrier-protéine [acp] synthase II (E.C. 2.3.1.179) :

• Réaction R04355 : acetyl-[acp] + malonyl-[acp] <=> acetoacetyl-[acp] + CO2 + acp
• Réaction R04952 : butyryl-[acp] + malonyl-[acp] <=> 3-Oxohexanoyl-[acp] + CO2 + acp

Enzyme bifonctionnelle E.C. 1.5.1.5 (5,10-methylene tétrahydrofolate:NADP⁺ oxidoreductase) et E.C. 3.5.4.9 (5,10-methenyltetrahydrofolate 5-hydrolase, ring-opening) :

• Réaction R01220 : 5,10-methylene tétrahydrofolate + NADP⁺ <=>5,10-methenyl tétrahydrofolate + NADPH
• Réaction R01655 : 5,10-methenyl tétrahydrofolate + H2O <=> 10-formyl tétrahydrofolate +H⁺

c. Prédiction d'enzymes promiscueuses à partir de modèles métaboliques

La méthode GEM-PROPER ("GEnome-scale metabolic Modeling PROmiscuity PrEdictoR") a permis d'identifier les enzymes promiscueuses à partir d'un modèle de reconstruction métabolique à l'échelle du génome de Escherichia Coli.

• Des arbres des gènes similaires ont été construits pour tous les gènes de Escherichia Coli (issus de la base de données SEED) en utilisant PSI-BLAST.
• Ces arbres ont permis de générer une matrice qui traduit les enzymes primaires et les enzymes promiscueuses potentielles (impliquées dans les voies métaboliques) de Escherichia coli codées par les gènes correspondants.
• Des gènes remplaçants ou de remplacement ("replacer genes") ont été identifiés dans cette matrice : ce type de gène code une enzyme qui a une fonction promiscueuse potentielle identique à la fonction primaire d'une enzyme codée par un autre gène essentiel (appelé gène cible, "target gene").
• Un gène de remplacement est validé si l'expression de ce gène empêche la mort cellulaire lors de l'élimination du gène cible.

La paire de gènes [cible-remplaçant] prédits [ΔpdxB/thiG] a été validée expérimentalement chez Escherichia Coli :

• Le gène cible pdxB (érythronate 4-phosphate déshydrogénase, E.C. 1.1.1.290) est impliqué dans la biosynthèse du pyridoxal 5'-phosphate (figure ci-dessous).
• Le gène remplaçant thiG code pour la [1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate:thiol sulfurtransférase] (E.C. 2.8.1.10) , une enzyme de la voie de biosynthèse du thiazole.
• L'activité promiscueuse pyridoxal 5'-phosphate synthase (P5PS) codée par le gène thiG permettrait de contourner les 6 étapes enzymatiques de la voie connue pour la synthèse du pyridoxal 5'-phosphate.

Source : Oberhardt et al. (2016)

Abréviations : ru5p-D = D-ribulose 5-phosphate; gln-L = L-glutamine; g3p = glycéraldéhyde 3-phosphate; glu-L = L-glutamate; Pi = phosphate.

Voir un cours sur les modèles de reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome.

5. La reconstruction (ou résurrection) de protéines ancestrales

a. Principe

Il existe deux moyens pour "ressusciter" des molécules biologiques disparues :

• Les extraire de l'environnement à partir de molécules fossiles. Ce moyen dépend de la conservation à long terme de ces molécules (les moins stables sont les acides nucléiques). Dans des conditions de températures basses (permafrost), on a récupéré :
  • L'ADN mitochondrial complet d'une mâchoire d'ours polaire de plus de 100.000 ans.
  • L'ADN d'un os de cheval de plus de 500.000 ans qui a été séquencé.
  • L'ADN le plus ancien a été extrait de carottes de glace du Groenland et date de 450.000 à 800.000 ans.

• La deuxième méthode est la "résurrection" des molécules biologiques avec des outils bioinformatiques suivie de leur synthèse. Les tentatives de ressusciter des protéines anciennes ont conduit, entre autre, à l'obtention de nouvelles structures moléculaires qui peuvent s'avérer des outils utiles dans divers domaines.

La reconstruction de séquences ancestrales ("Ancestral Sequence Reconstruction", ASR) permet d'étudier les séquences et les propriétés des protéines ancestrales.

• Un alignement de séquences multiples de protéines actuelles (ou plus anciennes mais dont on possède la séquence via des fossiles) permet de construire un arbre phylogénétique.
• La validité de cet arbre est déterminante car les séquences des protéines de ce que l'on considère comme des ancêtres spécifiques sont déduites de cet arbre.
• Les gènes correspondant à ces séquences puis les protéines ancestrales qu'ils codent sont ensuite synthétisés.
• Enfin, les protéines ancestrales "ressuscitées" sont caractérisées expérimentalement.

La résurrection de protéines ancestrales présente un fort potentiel biotechnologique.

Voir le projet "Ancestral Sequence Reconstruction Engineering of Coagulation Factors".

b. Illustration : reconstruction de β-lactamases ancestrales

Analyse phylogénique des β-lactamases de classe A

Il existe 4 classes (A, B, C et D) de β-lactamases : la classe A (hydrolase à sérine de type pénicillinase) est la plus courante.

La phylogénie des séquences de ces β-lactamases a été construite avec une méthode bayésienne :

• L'analyse a utilisé 2 séries indépendantes de chaînes de Markov (Monte Carlo, 4 chaînes par série) et a été réalisée sur 4 millions de générations pour assurer la convergence.
• Des arbres ont été échantillonnés toutes les 1000 générations pour chaque série, soit un total de 8000 arbres à partir desquels un arbre consensus a été obtenu avec des probabilités élevées aux nœuds.
• Les séquences ancestrales ont été reconstruites en utilisant PAML (modèle de substitution Wag et distribution γ pour les taux de remplacement variables à travers les sites).

La phylogénie des β-lactamases de classe A a permis de cibler des noeuds remontant à l'époque du Précambrien (arbre des eubactéries) : dernier ancêtre commun des entérobactéries (ENCA), dernier ancêtre commun des gamma-protéobactéries (GPBCA), dernier ancêtre commun de diverses bactéries Gram- (GNCA) et dernier ancêtre commun de diverses bactéries Gram- et Gram+ (PNCA).

Source : Risso et al. (2013)

Synthèse et propriétés structurales et fonctionnelles des β-lactamases ancestrales

Ces β-lactamases ancestrales (âge estimé de 2 à 3 milliards d'années) ont été synthétisées puis caractérisées expérimentalement :

• Malgré de grandes différences de séquences avec les β-lactamases actuelles (environ 100 acides aminés), les enzymes ressuscitées se replient correctement dans la structure canonique des lactamases.
• Les β-lactamases ancestrales reconstituées sont dénaturées par la chaleur selon un processus à 2 états et sont caractérisées par une température de dénaturation nettement plus élevée (environ 35°C) que les β-lactamases actuelles. Ce résultat est en faveur de l'hypothèse que la vie au Précambrien était caractérisée par des propriétés thermophiles.
• Elles dégradent différents antibiotiques (benzylpenicilline, cefotaxime et ceftazidime) in vitro avec une efficacité catalytique comparable aux β-lactamases actuelles.
• Cette promiscuité de substrat accrue n'est pas accompagnée de changements conformationnel significatif du site actif.
• Enfin, les β-lactamases ancestrales dotent Escherichia coli de niveaux de résistance significatifs à ces antibiotiques et d'autres.

Dans le cas des β-lactamases ancestrales, une stabilité élevée et une promiscuité accrue (susceptibles de contribuer à une évolutivité élevée) sont des atouts pour l'étude de l'évolution des protéines et pour élaborer des échafaudages protéiques afin de concevoir de nouvelles molécules.