1. Introduction

2. Origine génomique des microprotéines et micropeptides

a. Les "small Open Reading Frames" ou smORF
b. Pri-miARN et micropeptides

3. Techniques d'isolement et d'analyse des ARN traduits

4. Exemples de microprotéines ou micropeptides et de leurs diverses fonctions biologiques

5. Rôles de microprotéines ou micropeptides bien caractérisés

6. Illustration de la microprotéine PIGBOS

7. Communication intracellulaire de la mitochondrie

8. Liens Internet et références bibliographiques

1. Introduction

L'analyse des génomes, des transcriptomes et des protéomes révèle l'existence de milliers de courts cadres de lecture ouverts (smORF - "small Open Reading Frame", parfois sORF - "short Open Reading Frame") qui sont traduits mais non annotés comme tel.

La découverte de ces smORF et des microprotéines ou micropeptides pour lesquels ils codent ("smORF-Encoded Polypeptide", SEP) :

• Souligne les lacunes dans les annotations des génomes et des ARN.
• Indique que les caractéristiques de certains gènes codant des protéines nous sont encore méconnues.

Bien qu'il n'y ait pas de bornes "officielles", on considère généralement :

• 2 acides aminés < un peptide < 50 acides aminés
• une protéine > 50 acides aminés (les protéines des eucaryotes ont une longueur médiane de 361 acides aminés)

Avant la découverte des smORF et des microprotéines ou micropeptides, on considérait que la plupart des peptides et des petites protéines avaient pour origine la maturation de la chaîne polypeptidique de longs précurseurs par hydrolyse (protéolyse). Par exemple, le glucagon est une hormone de 29 acides aminés produite par le pancréas quand le taux de glucose sanguin baisse. Le glucagon est synthétisé sous forme d'un précurseur : le proglucagon qui est hydrolysé en 8 chaînes polypeptidiques.

Source : Drucker D.J. (2005)

• Glycentine : polypeptide N-terminal de 69 acides aminés du proglucagon
• GRPP : "glicentin-related pancreatic polypeptide"
• Oxyntomoduline : peptide de 37 acides aminés qui stimule la sécrétion d'insuline
• Glucagon
• GLP-1 : "glucagon-like peptide 1" (3 peptides différents), hormone peptidique de 30 acides aminés
• GLP-2 : "glucagon-like peptide 2", peptide de 33 acides aminés co-sécrété avec GLP-1, l'oxyntomoduline et la glicentine, par les cellules L entéroendocrines
• IP1 et IP2 : "intervening peptide" - MPGF : "major proglucagon fragment"

Exemple 1

• Une analyse utilisant un très grand nombre de techniques bioinformatiques et de méthodes expérimentales (Lu et al., 2019) a permis de mettre en évidence 3330 ARN longs non codants ("long non-coding RNA", lncRNA) liés aux ribosomes avec une élongation de la traduction active.
• 308 nouvelles protéines codées par ces lncRNA ont été détectées, dont 10 ont été confirmées par immunoréactivité.

Exemple 2

• Une étude de 80 coeurs humains a permis d'établir le "translatome" cardiaque (van Heesch et al., 2019) et de découvrir des centaines de microprotéines.
• Les données sont accessibles via une interface web. Choisir l'onglet "Browse cardiac microproteins" : de très nombreuses informations sont fournies, en particulier la séquence des microprotéines et la prédiction de leurs structures secondaires et tertiaire (I-Tasser).

Exemple 3

La comparaison de la distribution de la longueur des peptides de Saccharomyces cerevisiae (souche S288C) à partir des annotations en 1997 et en 2015 révèle que les changements les plus prononcés sont associés aux produits de la traduction des smORF. Chaque barre des histogrammes représente 50 résidus d'acides aminés.

Source : Erpf & Fraser (2018)

Voir une liste des smORF prédites à partir des génomes entiers et des régions intergéniques de plusieurs génomes de champignons.

2. Origine génomique des microprotéines et micropeptides

a. Les "small Open Reading Frames" ou smORF

Les transcrits ARN messagers contiennent plusieurs cadres de lecture ouverts (ORF) de longueurs variables (flèches grises) :

Source : Makarewich & Olson (2017)

• En règle générale, l'ORF la plus longue code pour la protéine fonctionnelle (flèche rouge, figure du milieu).
• Dans le cas de microprotéines (petite flèche rouge, figure de droite), trouver l'ORF correcte est difficile car la plus longue n'est souvent pas la région codante et la véritable ORF codante est "noyée" dans le bruit de fond que constituent les ORF non codantes "parasites".

La plupart des ORF des génomes animaux sont des smORF dans des régions non transcrites (ORF intergéniques en bleu clair) et sont considérées comme non fonctionnelles. Les ORF de 101 codons ou plus (ORF canoniques en violet) sont généralement traduites en protéines annotées avec des fonctions prédites.

Source : Couso & Patraquim (2017)

Les smORF de 10 à 100 codons (codant des microprotéines potentiellement fonctionnelles) peuvent être classées selon le type de transcrit pour lequel elles codent :

• Les ORF en amont ("upstream ORF", uORF) situées dans les régions 5' non traduites ("5′ UnTranslated Regions", 5'UTR) des ARN messagers canoniques.
• Les ORF non codantes longues ("long non-coding ORF", lncORF) dans les ARN longs non codants ("long non-coding RNA", lncRNA).
• Les séquences codantes courtes ("short CoDing Sequences", short CDS) qui sont des ORF annotées de 100 codons ou moins dans les ARN messagers courts.
• Les ORF isoformes courtes ("short isoform ORF") de 100 codons ou moins générées par un épissage alternatif d'ARN messagers.

Source : Couso & Patraquim (2017)

Exemples d'outils bioinformatiques pour la recherche de ces types d'ORF

• HAltORF ("Human Alternative Open Reading Frames") : base de données de cadres de lecture ouverts alternatifs - prédits hors cadre, chez l'homme. Elle est devenue la base de données OpenProtein.
• uPEPperoni: outil en ligne pour la localisation de cadres de lecture ouverts en amont et l'analyse de la conservation des transcrits.

b. Pri-miARN et micropeptides

Les miARN sont synthétisés dans le noyau sous forme de pri-miARN ("primary-miRNA") à partir des gènes (poly-cistrons) miRNA transcrits par l'ARN polymérase II ou III. Certains pri-miARN contiendraient des smORF codant des micropeptides.

• Les pri-miARN ont une longueur de 500 à 3000 nucléotides.
• Ils ont une coiffe en 5' comme l'indique l'existence d'un site de fixation à eIF4E. Le facteur eIF2C2 participe aussi à ce processus.

Source : Wang et al. (2019)

Exemples chez les plantes :

• Le pri-miR171b de Medicago truncatula code le micropeptide miPEP171b (20 acides aminés) et le pri-miR165a d'Arabidopsis thaliana code le micropeptide miPEP165a (18 acides aminés). Ces micropeptides augmentent l'accumulation de leurs propres miARN matures, ce qui induit une régulation négative des gènes cibles impliqués dans le développement des racines.
• Le pri-miR172c du soja code le micropeptide miPEP172c qui stimule la nodulation.

Chez l'homme, les pri-miR200a et pri-miR200b codent respectivement les micropeptides miPEP200a (187 acides aminés) et miPEP200b (54 acides aminés) qui inhibent la progression du cancer.

3. Techniques d'isolement et d'analyse des ARN traduits

Le translatome correspond à toutes les entités biologiques directement impliquées dans la traduction : les ARN messagers en cours de traduction (appelés "Ribosome Nascent-chain Complex messenger RNA", RNC-mRNA), les ribosomes, les ARN de transfert, certains ARN régulateurs (miRNA, lncRNA, ...). Le domaine en omique est la translatomique.

Les techniques les plus utilisées pour l'étudier sont :

• le profil des polysomes ("polysome profiling")
• le profil ribosomique (ou profilage des ribosomes, "ribosome profiling")
• le profil de traduction des ARN messagers pleine longueur ("full-length translating mRNA profiling", RNC-seq)
• la purification par affinité des ribosomes en cours de traduction ("translating ribosome affinity purification", TRAP-seq)

Le profil polysomique et le profil ribosomique d'une part, ou la purification par affinité et le profil ribosomique d'autre part, peuvent être combinés en utilisant l'une de ces méthodes pour enrichir l'échantillon en ribosomes avant d'isoler les fragments protégés par ces ribosomes.

Source : King & Gerber (2016)

Les extraits cellulaires sont généralement préparés en présence de cycloheximide, un antifongique, puissant inhibiteur de l'allongement de la traduction.

Profil polysomique ("polysomal profiling")

• Les extraits cellulaires sont séparés par ultracentrifugation dans un gradient de densité linéaire de saccharose (10 à 50%).
• Le gradient est ensuite fractionné en mesurant l'absorbance à 254 nm afin de séparer les ARN libres de la petite (40S) et de la grande (60S) sous-unités ribosomales, des monosomes (80S) et des polysomes.
• Les ARN sont ainsi isolés puis analysés avec une puce à ADN ou plus fréquemment maintenant par séquençage RNA-seq à haut débit.

Purification par affinité ("Translating Ribosome Affinity Purification" - TRAP)

• Les ribosomes sont marqués par un marqueur d'affinité (par exemple la GFP ou la protéine A).
• Les ribosomes sont ensuite capturés dans les extraits cellulaires par des anticorps ou des ligands spécifiques de ces marqueurs, couplés à une matrice.
• Après plusieurs lavages spécifiques, les ribosomes sont libérés : les ARN qui y sont fixés sont analysés (puces à ADN ou séquençage RNA-seq).

Profil ribosomique ("ribosomal profiling" ou "deep sequencing of ribosome-protected RNA fragments")

• Les extraits cellulaires sont traités par la RNase I pour hydrolyser les régions non protégées et non liées aux ribosomes des ARN messagers.
• Les extraits sont enrichis en ribosomes avec du saccharose ("sucrose cushion") et les fragments d'ARN protégés par les ribosomes ("ribosome protected fragments", RPF) sont fractionnés selon leur taille par électrophorèse.
• Des RPF (environ 24 - 26 nucléotides pour les procaryotes et 28 - 30 nucléotides pour les eucaryotes) sont récupérés et ligaturés à des adaptateurs de séquençage (transcription inverse, amplification et séquençage RNA-seq).
• La densité des RPF est proportionnelle au taux d'initiation de la traduction et inversement proportionnelle à la vitesse d'élongation.
• La technique du profil ribosomique est caractérisée par un taux important de faux positifs. De plus, les régions non traduites ("UnTranslated Regions", UTR) peuvent ne pas être analysées correctement.
• Les ADNc issus des ARN ribosomaux sont généralement épuisés avant amplification.

Source : Makarewich & Olson (2017)

Exemples d'outils bioinformatiques pour l'analyse des smORF révélés par les profils ribosomiques

• Ribosome Release Score (RRS) : programme pour détecter des régions traduites à l'aide de données de profils ribosomiques. Il mesure la libération des ribosomes au niveau des codons stop les plus probables. Ce programme distingue les gènes transcrits en ARN messagers et les gènes transcrits en ARN non codants.
• PRICE : méthode de calcul pour évaluer le niveau de bruit expérimental d'expériences de profils ribosomiques pour la prédiction de smORF eucaryotes. Il permet de résoudre avec précision les smORF et les sites d'initiation de la traduction non canoniques qui se chevauchent.
• ORF-RATER : programme d'annotation des séquences codant des protéines, basé sur une méthode de régression à partir de données de profils ribosomiques.

4. Exemples de microprotéines ou micropeptides et de leurs diverses fonctions biologiques

La première microprotéine identifiée est la protéine "Inhibitor of DNA-binding" (ID) qui interagit et inhibe les facteurs de transcription de type hélice-boucle-hélice (Benezra et al., 1990).

Les premières microprotéines végétales découvertes sont les protéines "Little zipper" (ZPR) qui contiennent un seul domaine fermeture éclair à leucine (Wenkel et al., 2007). Elles interagissent avec les protéines à homéodomaine fermeture éclair à leucine de classe III et l'hétérodimère résultant est incapable d'interagir avec l'ADN.

5. Rôles de microprotéines ou micropeptides bien caractérisés

Les microprotéines sont des modulateurs importants et puissants des processus biologiques. En effet :

• Elles ont la capacité d'interférer avec des protéines plus grosses et de les empêcher de s'engager dans des complexes protéiques d'ordre supérieur
• Elles peuvent aussi séquestrer leurs cibles dans d'autres types de complexes fournissant ainsi de nouvelles activités.

L'analyse des interactions des microprotéines avec d'autres protéines permet d'étudier leur fonction dans la cellule. On peut, par exemple, étiqueter la microprotéine d'intérêt avec un peptide tel que FLAG ou APEX2, puis l'isoler avec ses partenaires en interaction à l'aide d'anticorps qui se lient à cette étiquette.

Exemples de fonctions biologiques très diverses de microprotéines ou micropeptides

MOTS-c et l'humanine sont des micropeptides codés par des smORF du génome mitochondrial :

• MOTS-c (16 acides aminés) contribuent à l'homéostasie métabolique : il a des effets de type endocrinien sur le métabolisme musculaire, la sensibilité à l'insuline et la régulation du poids.
• L'humanine abolit l'apoptose en empêchant la translocation du cytoplasme dans la mitochondrie de Bax (protéine X associée à Bcl2), protéine qui induit l'apoptose.
• Voir un développement ci-dessous.

Le micropeptide MRI-2 améliore la jonction des extrémités non-homologues ("Non-Homologous End Joining", NHEJ) des cassures d'ADN double brin ("Double-Strand DNA Breaks", DSB) en s'associant aux protéines Ku, protéines de liaison des extrémités de l'ADN.

Source : Yeasmin et al. (2018)

Les micropeptides myomixer et minion stimulent la fusion du myoblaste au cours de la formation de la myofibre musculaire en association avec la protéine myomaker.

Le micropeptide SPAR est localisé dans le lysosome où il interagit avec le complexe v-ATPase et régule l'activation de la protéine mTORC1 au cours de la cascade de signalisation liée au stress.

NoBody est un micropeptide qui dissocie les granules de dégradation des ARN ("Processing bodies" ou "P-bodies") en interagissant avec le complexe d'enlèvement de la coiffe des ARN messagers.

La myoréguline (MLN, 46 acides aminés), le phospholambane (PLN, 52 acides aminés), la sarcolipine (SLN, 31 acides aminés) et une autre réguline (ALN) sont des microprotéines qui interagissent avec les enzymes SERCA (pompes ATPase calciques) dans le réticulum sarcoplasmique et le réticulum endoplasmique (S/ER) et contribuent à l'homéostasie du calcium cellulaire.

Ces microprotéines sont des protéines transmembranaires intégrales.

Source : Anderson et al. (2016)

MiPepid: outil d'identification de micropeptides par l'apprentissage automatique.

6. Illustration de la microprotéine PIGBOS

Le gène PIGBOS (OS pour "Opposite Strand") se trouve sur le brin opposé du gène de "PhosphatidylInositol Glycan anchor biosynthesis class B" ou PIGB. Le gène codant PIGBOS contient 2 exons, le second contenant la smORF PIGBOS entière.

Le transcrit PIGBOS génère 3 isoformes issues de l'épissage. Les données de RNA-seq et de profil ribosomique prouvent la transcription et la traduction de PIGBOS dans 3 lignées cellulaires humaines différentes.

• Des anticorps dirigés contre PIGBOS de l'homme et du rat démontrent que c'est une microprotéine stable et fortement synthétisée.
• PIGBOS est une microprotéine de 54 acides aminés dont la séquence est conservée.
• Un score PhyloCSF ("Codon Substitution Frequencies") positif suggèrent qu'elle est fonctionnelle. PhyloCSF est un logiciel qui détermine si un alignement de séquences nucléotidiques multi-espèces est susceptible de représenter une région codant une protéine.
• La microprotéine PIGBOS est localisée dans la membrane externe mitochondriale : les régions transmembranaires (acides aminés 7 à 29) forment un dimère.

Source : Chu et al. (2019)

7. Communication intracellulaire de la mitochondrie

Les mitochondries communiquent avec le reste des composants cellulaires via de multiples molécules de natures très diverses comme des fragments d'ADN mitochondrial, des lipides mitochondriaux (par exemple, la cardiolipine), des métabolites et des petits peptides.

Ces mécanismes de communication ne sont pas forcément liés à un dysfonctionnement mitochondrial, mais utilisés comme informations sur la base de divers indices (par exemple, le flux de nutriments ou les états rédox).

Les peptides dérivés des mitochondries ("Mitochondrial Derived Peptides", MDP) sont des micropeptides de signalisation codés par des smORF du génome mitochondrial.

• L'humanine est un peptide de 24 acides aminés codé par le gène MT-RNR2 de l'ARN ribosomal 16S :
  1. La protéine Bax induit l'apoptose : en effet, en réponse au stress, Bax peut se déplacer du cytosol vers la membrane externe mitochondriale où elle s'insère et favorise la mort cellulaire par la libération de cytochrome C et d'autres protéines apoptogènes. Dans les cellules de mammifères, l'humanine peut se lier à la protéine Bax ce qui empêche la translocation de Bax et donc l'apoptose.
  2. La fonction cytoprotectrice de l'humanine est médiée par son interaction avec les composants intracellulaires et extracellulaires. Ce rôle protecteur de l'humanine a également été démontré pour le réticulum endoplasmique (restauration du taux de glutathion mitochondrial appauvri par le stress lié au RE).

• Un autre MDP de type humanine, SHLP2 ("Small Humanin-Like Peptide 2"), cible spécifiquement les grains d'amyloïdes et inhibe le mauvais repliement de la chaîne polypeptidique amyloïde.

• Le court cadre de lecture ouvert de l'ARNr 12S mitochondrial code un micropeptide de 16 acides aminés, MOTS-c ("Mitochondrial Open-reading-frame of the Twelve S rRNA - c") qui favorise l'homéostasie métabolique et prévient le stress métabolique via sa translocation dans le noyau (régulée par l'AMP kinase).

Source : Valera-Alberni & Canto (2018)

• Les mitochondries sont également l'une des principales sources d'acétyl-CoA nécessaires aux histones acétyltransférases (HAT) pour l'acétylation des histones et la conformation de la chromatine transcriptionnellement active.
• L'α-cétoglutarate (αKG) formé au cours du cycle de l'acide tricarboxylique (TCA) est le substrat des enzymes de translocation ("ten-eleven translocation", TET) de l'histone déméthylase.
• Les mROS sont générés principalement par les complexes I et III de la chaîne de transport d'électrons et diffusent dans le cytoplasme pour activer diverses voies de signalisation et réguler la transcription de gènes spécifiques.

Les mitochondries sont des plateformes de signalisation anti-virale et, en raison de leur origine bactérienne, l'ADN mitochondrial et d'autres composants mitochondriaux déclenchent des réponses immunitaires innées et une pathologie inflammatoire. La libération dans le cytoplasme d'ADN mitochondrial active la voie cGAS ("Cyclic GMP-AMP synthase") - STING - TBK1 qui active la transcription du gène stimulé par l'interféron qui favorise l'immunité antivirale.

• Ainsi, lorsqu'il est endommagé, l'ADN mitochondrial en avertit le noyau.
• En effet, il semble que les dommages et la libération subséquente de l'ADN mitochondrial provoquent une réponse protectrice qui augmente la réparation de l'ADN nucléaire, l'ADN mitochondrial jouant un rôle de "sentinelle de stress génotoxique".